桑葉生物堿對D-半乳糖誘導小鼠腸道屏障損傷的改善作用及機理

賀 燕，黃先智，韋 崢，郝麒麟，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

腸道不僅是體內營養物質消化吸收的關鍵場所，還是重要的屏障防御系統，能夠抵抗外來有害物質侵入腸道，同時阻止腸腔內細菌及毒素進入體內對機體造成傷害[1]。腸道屏障是抵御有害刺激的第一道防線，由腸上皮細胞及細胞間緊密連接、黏液層等構成[2]。由于腸上皮組織位于機體與腸腔的界面處，因此易受到飲食、藥物或有害物質等刺激產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），引發氧化應激，最終導致上皮細胞凋亡或緊密連接蛋白結構受損，腸道屏障完整性被破壞[3-4]。目前常通過攝入化學合成藥物治療腸道疾病，但藥物易刺激腸道而造成二次傷害[5]。因此，探究安全、無毒的天然活性物質對腸道損傷的改善作用成為研究熱點。

生物堿是一種重要的天然活性成分。已有研究表明生物堿類物質如小糪堿[6]、苦參堿[7]等，可顯著減輕腸道黏膜損傷和腸細胞壞死，并能上調緊密連接蛋白的表達水平，改善腸道屏障損傷。桑葉生物堿是一類從桑葉中分離得到的、以1-脫氧野尻霉素為主要成分的哌啶烷類生物堿，具有水溶性好、生物活性高、無細胞毒性的特點[8]。大量研究已證實桑葉生物堿具有顯著的抗氧化功效，能夠增加抗氧化酶的活力及非酶抗氧化劑的含量，減輕機體的氧化應激損傷[9-10]。王祖文[11]證實桑葉生物堿能夠改善肝臟損傷，該研究通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法對肝纖維化小鼠的肝組織切片進行病理學觀察，顯示桑葉生物堿可顯著改善模型小鼠中肝細胞排列紊亂、肝小葉結構模糊、膠原大量沉積等現象，改善小鼠肝纖維化現象。考慮到目前鮮有關于桑葉生物堿對腸道損傷的改善作用及機制的研究報道，本研究以D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導建立小鼠腸道損傷模型，通過對腸組織切片進行病理學觀察，以及測定3種重要的緊密連接蛋白（閉合蛋白（Occludin）、Claudins、ZO-1）的mRNA表達水平，探討桑葉生物堿對腸道屏障損傷的改善作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及試劑

SPF級4周齡雄性昆明種小鼠60只，體質量為（20±2）g，購于湖南省斯萊克公司（生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002）。基礎飼料購買于重慶醫科大學實驗動物中心。

桑葉粉末 重慶市蠶業科學技術研究院；D-Gal（純度≥99%）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）（純度≥98%） 北京索萊寶有限公司生產；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、腸型脂肪酸結合蛋白（intestinal fatty acid binding proteindityrosine，iFABP）酶聯免疫吸附試驗試劑盒、HE染色試劑盒 上海優選生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒 北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTMII（Til RNaseH Plus）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Symergy H1酶標儀 美國Christ公司；5880型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DW-HL438型超低溫冰箱合肥美菱股份有限公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度計 美國賽默飛世爾公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；T100T型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、GelDoc2000型凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；qTOWER3G型實時熒光定量PCR儀 德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉生物堿的制備和實驗動物的分組

桑葉生物堿為實驗室自制[10]，通過硅鎢酸沉淀法[12]測得總生物堿含量為（935.71±64.26）mg/g。此外桑葉生物堿多糖含量為（32.14±1.93）mg/g，黃酮含量為（21.97±1.69）mg/g。

本研究嚴格遵守西南大學《實驗動物保護和使用規則》。小鼠飼養在可自由進食和飲水的塑料籠中，每籠4～5只，控制動物房溫度（22±2）℃、相對濕度50%～70%、12 h明暗交替（8∶00～20∶00）。適應性喂養7 d后，隨機選取15只小鼠作為正常組，每天腹腔注射10 mL/kgmb生理鹽水；其余55只小鼠作為造模組，每天腹腔注射1 000 mg/kgmbD-Gal（注射體積為10 mL/kgmb）。連續注射45 d后分別從正常組和造模組隨機選取5只小鼠，麻醉后眼球取血，頸椎脫臼處死，收集血清，取出1只正常組小鼠和5只造模組小鼠的小腸組織并切取小腸組織中段2～3 cm固定在質量分數10%的福爾馬林溶液中，以進行切片和病理學觀察，測定血清中丙二醛、D-LA濃度和DAO活力，用于初步判斷小腸氧化損傷的情況。通過HE染色觀察小腸組織的病理學表現。綜合判斷小鼠小腸損傷模型是否成功。

保留10只正常組小鼠，將造模成功的50只小鼠隨機分為模型組，陽性對照組（每天灌胃200 mg/kgmbGSH），桑葉生物堿低、中、高劑量組（分別每天灌胃50、100、200 mg/kgmb桑葉生物堿，桑葉生物堿劑量根據前期預實驗確定，且經過毒理學實驗表明，高劑量的桑葉生物堿無毒副作用）。正常組和模型組每天灌胃生理鹽水，各組灌胃體積均為10 mL/kgmb，持續灌胃45 d。實驗期間，觀察小鼠的活動情況并記錄，每周測定小鼠體質量。

1.3.2 測定樣本的采集與制備

最后一次灌胃結束后，各組小鼠禁食不禁水16 h，乙醚麻醉后眼球取血于采血管中，靜置2 h后于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清并于－80 ℃下保存備用。小鼠采血后頸椎脫臼處死，立即取出小鼠小腸段組織，用預冷的4 ℃生理鹽水洗凈，吸水紙吸干表面水分后稱質量。

切取小腸組織中段2～3 cm固定在質量分數10%的福爾馬林溶液中，以進行切片和病理學觀察；剩下小腸段組織放入RNase free離心管中，－80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.3.3 血清指標測定

血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平的測定均分別按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 小腸組織病理學觀察

將小腸組織經石蠟包埋后的標本切成4 μm厚的切片，并用HE染色。光學顯微鏡觀察小腸組織的形態學變化。

1.3.5 小腸組織總RNA提取及反轉錄

按照試劑盒說明提取小腸組織RNA，檢測其質量合格后按照試劑盒方法反轉錄為cDNA。

1.3.6 實時熒光定量PCR

反應體系按照SYBR Green染料說明書操作配制，擴增程序：預變性94 ℃、4 min；變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、31 s，延伸72 ℃、20 s，40個循環。擴增結束后根據熔解曲線評估引物特異性，根據擴增目的基因及β-actin的Ct采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.4 實驗數據處理與分析

實驗結果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行多組樣本間差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 D-半乳糖誘導建立小鼠腸道損傷模型的結果

連續45 d腹腔注射1 000 mg/kgmbD-Gal后，分別測定正常組和造模組小鼠血清中丙二醛、D-LA濃度和DAO活力，并通過HE染色觀察小腸組織的病理學表現，結果如表2、圖1所示。

表2 小鼠血清中丙二醛濃度、D-LA濃度、DAO活力Table 2 Concentrations of malondialdehyde and D-LA and activity of diamine oxidase in serum of mice

圖1 實驗小鼠小腸組織的病理學表現（×200）Fig. 1 Pathological manifestations of small intestinal tissue in experimental mice (× 200)

由表2可知，正常組與造模組中丙二醛濃度、D-LA濃度和DAO活力存在顯著差異，初步提示腸道可能發生氧化應激損傷[13]。由圖1可知，正常組中小腸組織結構完整，細胞間緊密排列，造模組中小腸組織出現大量破碎、壞死細胞，提示小腸遭受嚴重損害。綜上，可判斷造模成功。

2.2 桑葉生物堿對小鼠生長發育的影響

小鼠生長發育是否良好可通過其外觀狀態、活動情況、體質量來判斷。造模結束時，與正常組小鼠相比，造模組小鼠活動變少，出現脫毛、毛色發黃等癥狀。這些癥狀在陽性藥物和桑葉生物堿干預45 d后大大減輕。灌胃期間桑葉生物堿對小鼠體質量的影響如圖2所示。

圖2 桑葉生物堿對小鼠體質量的影響Fig. 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on body mass in mice

如圖2所示，雖然各組小鼠的體質量在灌胃期間均呈增加趨勢，但與正常組相比，模型組小鼠體質量增加速率較慢，表明造模期間連續注射D-Gal可能造成后期不再給予D-Gal時小鼠體質量增長緩慢，小鼠生長發育受阻。灌胃結束時，與正常組相比，模型組小鼠體質量下降了15.31%。陽性對照組小鼠體質量較模型組增加了8.87%，但明顯低于正常組，表明灌胃GSH能促進小鼠體質量的增長，但未能使之恢復至正常水平，這可能與GSH具有較好的降脂功效，一定程度上控制了小鼠體質量的增加有關[14]。與模型組相比，桑葉生物堿低、中、高劑量組小鼠體質量分別增加了2.42%、10.12%、15.66%，且高劑量組小鼠在灌胃結束時體質量恢復至正常組水平，表明連續灌胃桑葉生物堿可有效改善小鼠生長受阻的現象。

2.3 桑葉生物堿對實驗小鼠血清中D-LA、LPS、iFABP和DAO水平的影響

腸道屏障的完整性通常用腸道通透性來衡量[15]。當腸上皮細胞或緊密連接蛋白結構受損時，腸通透性升高，腸屏障對物質的選擇滲透性能下降[16]。DAO是一種催化組胺二胺氧化的關鍵酶，iFABP是一種細胞內蛋白，這兩種物質均位于腸上皮細胞中[17-18]。研究表明ROS可直接作用于腸上皮細胞，使細胞膜上的磷脂雙分子層發生脂質過氧化而損傷膜結構，導致DAO和iFABP釋放入血液[19]。D-LA是腸道內細菌糖酵解途徑的代謝產物[20]，LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是導致宿主炎癥反應的關鍵物質[21]。當腸道屏障被破壞，腸通透性增加，細菌發生移位，D-LA和LPS隨之擴散到血液循環中[22-23]。因此，血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力可反映腸屏障完整性和通透性的變化[24]。桑葉生物堿對血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力的影響如表3所示。

表3 桑葉生物堿對小鼠血清D-LA、DAO、LPS、iFABP水平的影響Table 3 Effect of mulberry leaf alkalois on levels of D-LA, DAO, LPS and iFABP in serum of mice

由表3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平分別顯著上升了28.22%、34.86%、61.01%、40.56%（P＜0.05），表明模型組小鼠小腸屏障的完整性受到破壞，可能與ROS攻擊腸道上皮組織結構，使腸屏障受損有關。與模型組相比，陽性對照組血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平分別下降了23.08%、24.00%、32.16%、23.35%（P＜0.05），均恢復至正常組水平；桑葉生物堿低、中、高劑量組血清中D-LA濃度分別降低了9.82%、17.04%、22.14%（P＜0.05），DAO活力分別降低了13.59%、15.66%、23.22%（P＜0.05），LPS含量分別降低了14.64%、19.95%、32.12%（P＜0.05），iFABP質量濃度分別降低了4.18%（P＞0.05）、13.29%（P＜0.05）、19.98%（P＜0.05），其中桑葉生物堿高劑量組中D-LA、DAO、LPS水平與陽性對照組、正常組相比無顯著差異（P＞0.05），iFABP水平與陽性對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但與正常組相比差異顯著（P＜0.05）。上述結果表明，實驗劑量范圍內的桑葉生物堿能夠顯著降低血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平，有利于小腸屏障完整性和通透性的改善，其中高劑量的桑葉生物堿能使血清中D-LA、DAO、LPS恢復到正常水平，但在實驗劑量和時間范圍內還不能使iFABP恢復至正常水平。

2.4 桑葉生物堿對實驗小鼠小腸組織形態學的影響

HE染色法是對組織進行病理學觀察的可靠手段之一。本研究通過HE染色技術觀察正常和病變小腸組織的一般形態結構，以探究桑葉生物堿對模型鼠腸道屏障的改善作用。各組小鼠小腸組織切片的HE染色結果如圖3所示。

圖3 桑葉生物堿對實驗小鼠小腸組織病理學的影響（×200）Fig. 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on intestinal histopathology in mice (× 200)

如圖3所示，正常組小鼠小腸組織的病理學表現正常，組織結構完整，上皮細胞排列緊密，黏膜層未見明顯損傷。與正常組相比，模型組小鼠小腸組織細胞大量破碎，發生凋亡、壞死，排列紊亂，細胞間緊密連接結構被破壞。經GSH和桑葉生物堿干預后，小腸上皮結構損傷的程度逐漸減輕，其中以陽性對照組和桑葉生物堿高劑量組改善效果最好。與模型組相比，陽性對照組和桑葉生物堿高劑量組中小腸細胞形態正常，排列整齊規則，上皮結構完整，邊界清晰。表明桑葉生物堿可能通過改善細胞凋亡恢復小腸上皮組織結構的完整性，有效保護腸道屏障的完整。

2.5 桑葉生物堿對實驗小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平的影響

緊密連接蛋白在維持腸屏障完整性中起著重要的作用，控制著腸屏障的通透性，由跨膜蛋白Claudins、Occludin和外周膜蛋白ZOs組成[25]。Occludin是第一個被確定的緊密連接跨膜蛋白，定位于緊密連接處，可以通過細胞膜外的部分與相鄰細胞結合而產生細胞旁封閉，有助于控制細胞間的通透性[26]。Claudin-1能夠限制離子進入上皮細胞，并與鄰近細胞中的其他連接蛋白相互作用，形成避免脂質和蛋白質擴散的圍欄，調節緊密連接復合體的通透性[27]。ZO-1主要位于相鄰上皮細胞的邊界處，充當著細胞內支架蛋白，將Occludin、Claudin-1錨定到細胞骨架，協同控制腸屏障的通透性[28]。桑葉生物堿對小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平的影響如圖4所示。

圖4 桑葉生物堿對小鼠小腸組織中ZO-1（A）、Occludin（B）、Claudin-1（C）mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on mRNA expression levels of ZO-1 (A), occludin (B) and claudin-1 (C) in intestinal tissue of mice

如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平顯著下降了66.01%、73.44%、51.71%（P＜0.05），表明模型組小鼠腸屏障結構中緊密連接相關蛋白的基因表達水平顯著下降。桑葉生物堿干預后，隨著灌胃劑量的增加，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平呈現遞增的趨勢。與模型組相比，陽性對照組中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平分別顯著上升了171.61%、198.71%、100.53%（P＜0.05），均能恢復至正常組或者接近正常組水平。與模型組相比，桑葉生物堿低、中、高劑量組中ZO-1mRNA表達量分別顯著上升了59.47%、132.10%、154.67%（P＜0.05），OccludinmRNA表達分別增加了21.80%（P＞0.05）、133.02%（P＜0.05）、272.78%（P＜0.05），Claudin-1mRNA表達量分別增加了8.79%（P＞0.05）、45.62%（P＜0.05）、81.16%（P＜0.05）。其中桑葉生物堿高劑量組中ZO-1mRNA表達量與陽性對照相比無顯著差異（P＞0.05），但與正常組相比差異顯著（P＜0.05），Occludin、Claudin-1mRNA表達量與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，桑葉生物堿能夠通過調節模型組小鼠小腸ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA表達水平來恢復細胞間的連接結構，修復腸道屏障的結構損傷。在實驗時間和劑量范圍內，高劑量的桑葉生物堿僅能將Occludin、Claudin-1mRNA表達量恢復至正常水平。

2.6 ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平和D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的相關性分析結果

據報道，ZO-1、Occludin和Claudin-1的表達量下降時，細胞間緊密連接被破壞，通透性增加，腸道內大分子物質自由進出腸道，血液中相應物質的含量升高[29]。對ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平和D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的Pearson相關性分析，結果如表4所示。

表4 ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達量與D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的相關性分析結果Table 4 Correlation analysis between mRNA expression levels of ZO-1, occludin and claudin-1 and D-LA, DAO, LPS and iFBAP levels

如表4所示，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平與D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平呈顯著負相關，相關系數的絕對值在0.6～0.8之間，表明兩個變量之間呈現中度相關。結合以上結果可初步得出結論，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達量的下降，會促進D-LA、DAO、LPS、iFBAP進入血液，導致其在血清中含量升高。桑葉生物堿可通過上調ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平，提高細胞間緊密連接性，從而恢復腸道上皮屏障的完整性和通透性，進而阻止腸道中的分子物質進入血液循環。

3 討 論

D-Gal是一種還原糖，在正常濃度下會代謝為葡萄糖，但是D-Gal含量過高時，可在半乳糖氧化酶的催化下轉化為醛糖和氫過氧化物，導致ROS的大量產生，誘導氧化應激反應[30]。ROS是導致細胞損傷、死亡的重要物質，可誘導器官組織發生氧化損傷。因此，動物實驗中常通過連續注射D-Gal建立慢性損傷模型[14]。腸道屏障作為腸道抵御外界刺激最重要的一道防線，是由完整的腸上皮細胞和相鄰細胞間的緊密連接及黏液層構成，也稱作腸黏膜上皮屏障[31]。由于腸道是食物消化吸收的主要場所，腸道黏膜長期暴露在膳食脂肪和蛋白質氧化產物的促氧化作用下，可能會擾亂腸道的氧化還原狀態，導致氧化應激的發生[32]。作為破壞腸屏障的重要起始作用物質，ROS在腸道損傷早期起著至關重要的作用。ROS可通過氧化脂質和關鍵氨基酸，引起細胞基本結構被破壞，導致上皮組織的完整性喪失，通透性增加[33]。鮑偉光[34]、鄒軼[35]等的研究均顯示氧化應激條件下腸道絨毛斷裂，上皮細胞的基本結構遭受了嚴重損害。在大多數研究中通常使用一些血液指標來指示腸道完整性和通透性，以評估腸屏障受損的程度。這些指標包括D-LA、DAO、LPS、iFABP水平[36]。正常情況下，血液中D-LA、DAO、LPS和iFABP的水平很低。當腸屏障結構被破壞，這些物質會通過受損的組織進入血液，所以通過測定血液中相應物質的含量可判斷腸道損傷的情況。根據珠娜等[37]的研究顯示，輻射產生的大量ROS會攻擊小鼠腸上皮結構，導致腸絨毛萎縮、斷裂，細胞變性壞死，血清中D-LA、LPS水平及DAO活力顯著升高，并且其水平與腸道氧化損傷的程度成正比。本研究中，模型鼠血清中D-LA、LPS、iFABP水平和DAO活力較正常組顯著升高，提示在D-Gal誘導下，小腸屏障結構可能發生了損傷。灌胃桑葉生物堿和陽性藥物GSH后，可顯著降低模型鼠血清中相關指標的含量，以高劑量的桑葉生物堿作用效果最好。表明桑葉生物堿可有效修復腸黏膜上皮結構損傷。吳國泰[38]的研究中顯示，甘青烏頭的總生物堿能夠上調腸炎大鼠回腸組織中DAO活力，從而降低血清中DAO活力，有效修復腸屏障損傷。為了更加直觀地觀察桑葉生物堿對腸道屏障損傷的改善效果，對實驗小鼠的小腸組織切片進行了病理學觀察。結果顯示，桑葉生物堿可有效改善模型鼠中腸細胞壞死、破碎、排列紊亂的現象，恢復細胞間的緊密連接結構。這與蔣曉梅等[39]的研究結果相似，該研究證實黃連總生物堿能夠降低結腸炎大鼠腸黏膜損傷，促進腸細胞增長，改善腸屏障功能障礙。

ROS破壞腸道屏障的一種重要機制是通過直接或間接改變緊密連接蛋白的分布和表達[14]。腸上皮屏障中，緊密連接蛋白以Occludin、Claudins和ZO-1等組成的多聚體復合物存在，具有選擇滲透性，通過細胞旁途徑調節離子、溶質和水進出腸道，而阻止有毒大分子或有害物質通過，對維持腸道屏障完整性和通透性至關重要[40]。袁敏蘭等[41]研究表明持續的氧化應激造成腸屏障結構被破壞，腸組織的通透性增加，表現為腸道切片中細胞完整性喪失、排列紊亂，Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表達水平顯著下降。本研究中，與正常組相比，模型組小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平均顯著下降，灌胃GSH和桑葉生物堿后，三者的表達量均顯著上升，其中高劑量的桑葉生物堿能將Occludin、Claudin-1mRNA表達量恢復至正常組水平。Pearson相關性分析結果表明，D-LA、DAO、LPS、iFABP水平與ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平呈現出顯著負相關。研究表明，桑葉生物堿可能通過上調ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平，恢復細胞間的緊密連接結構，改善腸道屏障的完整性和通透性，從而阻止腸腔內物質進入血液循環中。其他生物堿也有相似的調節作用，Yu Xiuting等[42]發現，向模型鼠灌胃小檗堿可顯著提高其結腸ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Occludin等的蛋白表達水平，有效改善結腸黏膜屏障損傷，恢復其完整性。

綜上所述，不同劑量的桑葉生物堿可顯著降低模型小鼠血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力，改善腸上皮細胞凋亡、排列紊亂的現象，其機制可能與其顯著上調ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表達水平，改善腸細胞凋亡、壞死，恢復細胞間的緊密連接結構有關。本項研究結果有助于小腸屏障損傷的預防和治療，也為桑葉生物堿的開發利用提供了理論依據。