生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠降血脂作用和膽汁酸代謝的影響

常 青，鄭寶東,2，張 怡,2，曾紅亮,2,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe），是姜科、姜屬的多年生草本植物的新鮮根莖，是我國(guó)藥食兩用的特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量居全球首位[1]。生姜中淀粉質(zhì)量占干質(zhì)量的40%～70%，是生姜根莖中主要的碳水化合物。目前，生姜主要以鮮姜、干姜和姜粉為主，其深加工產(chǎn)品較少，研究主要集中于生姜小分子活性物質(zhì)上，大量的淀粉在經(jīng)過(guò)提取之后被丟棄，造成了資源的浪費(fèi)[2]。前期研究表明，生姜淀粉顆粒呈三角形片狀，與大宗淀粉顆粒存在明顯的差異，為特異性的淀粉顆粒；而且生姜淀粉中天然抗性淀粉顆粒約占70%以上，其中直鏈淀粉占35%，加工過(guò)程中易老化生成III型抗性淀粉[3]。

抗性淀粉在小腸內(nèi)不能被健康人體所利用，但能在大腸中被腸道微生物發(fā)酵或部分發(fā)酵代謝，產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乳酸和其他少量氣體[4]。抗性淀粉分為5大類(lèi)，分別為I型物理包埋淀粉、II型天然抗性淀粉顆粒、III型回生淀粉、IV型化學(xué)改性淀粉和V型淀粉酯質(zhì)復(fù)合物[5]。抗性淀粉作為一種新型的膳食纖維，以多種方式參與調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝、膽固醇合成和分解、脂肪酸的攝入和氧化、膽汁酸的合成和代謝等生理過(guò)程，在維持或改善脂質(zhì)代謝平衡、防止脂肪過(guò)度沉積中發(fā)揮著重要的作用[6-8]。膽汁酸是機(jī)體重要代謝信號(hào)分子，不僅能夠參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝，還能參與機(jī)體脂質(zhì)、葡萄糖和能量平衡的調(diào)節(jié)[9]。膽汁酸可分為初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸，初級(jí)膽汁酸在肝臟中膽汁酸合成酶的催化下由膽固醇轉(zhuǎn)化而來(lái)；次級(jí)膽汁酸是初級(jí)膽汁酸經(jīng)膽囊分泌到腸道中，在腸道菌群的催化下經(jīng)過(guò)修飾及轉(zhuǎn)化等作用生成[10-11]。機(jī)體膽汁酸池的容量和組成變化會(huì)引起血清中膽汁酸代謝輪廓譜的變化，而血清膽汁酸的含量和組成可影響肝腸膽汁酸的循環(huán)[12]。

因此，本研究采用高脂飼料誘導(dǎo)SD大鼠形成高脂血癥動(dòng)物模型，以普通飼料為正常對(duì)照（normal control，NC），以辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照（positive control，PC），以高直鏈玉米淀粉（high amylose maize starch，HMS）為普通對(duì)照，采用灌胃方式，研究3種生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠生理指標(biāo)的影響，分別測(cè)定大鼠攝食量，體質(zhì)量增加量，大鼠血清中甘油三酯（total triglyeride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平等血脂指標(biāo)；采用光學(xué)顯微鏡觀察血管、結(jié)腸和肝臟等組織病理學(xué)特征，并測(cè)定結(jié)腸絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度等腸道形態(tài)學(xué)指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，采用靶向代謝組學(xué)技術(shù)測(cè)定血清中25種初級(jí)和次級(jí)膽汁酸含量，構(gòu)建血清膽汁酸代謝輪廓譜，以期為生姜抗性淀粉調(diào)控腸道菌群介導(dǎo)膽汁酸代謝機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物編號(hào)：20170005031590，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

新鮮生姜 福建省三明市大田生姜專(zhuān)業(yè)合作社；動(dòng)物飼料 閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司；辛伐他汀上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司；蘇木素-伊紅染液（hematoxylin-eosin staining，HE） 武漢谷歌生物科技有限公司；碳酸利多卡因注射液 四環(huán)藥業(yè)股份有限公司；乙腈、甲醇 美國(guó)Fisher Scientific公司；其余試劑藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AU2700全自動(dòng)生化分析儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)AB SCIEX公司；Viscotek TDA305max多檢測(cè)器凝膠滲透色譜儀英國(guó)Malvern公司；病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī) 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗性淀粉的制備

生姜原淀粉、II型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 2，GRS2）、III型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 3，GRS3）、IV型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 4，GRS4）的制備和純化方法參考常青[13]的方法進(jìn)行，獲得的GRS2、GRS3和GRS4中抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（95.78±2.44）%、（95.36±2.16）%和（92.46±1.97）%。

1.3.2 飼料的制備

高脂飼料配方：89.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）普通飼料、5.00%蛋黃粉、5.00%豬油、0.50%膽固醇和0.25%豬膽鹽。普通飼料符合GB 14924.3—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》。

1.3.3 動(dòng)物分組和給藥方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在福建中醫(yī)藥科學(xué)研究院比較醫(yī)學(xué)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查編號(hào)：FJATCM-IAEC2020016。

動(dòng)物分組和給藥方法如下：雄性大鼠84只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水飲食。按體質(zhì)量隨機(jī)分成2組，一組12只給予基礎(chǔ)飼料，一組72只給予高脂飼料，喂養(yǎng)2周后，將基礎(chǔ)飼料組分別淘汰體質(zhì)量最高和最低的3只，剩余6只為NC組，繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料4周，每日灌胃生理鹽水2 mL/100 gmb。高脂飼料組喂養(yǎng)2周后，淘汰體質(zhì)量較高的肥胖敏感大鼠18只和體質(zhì)量較低的肥胖抵抗大鼠18只，剩余36只大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。

高脂模型（hyperlipidemic model，HM）組：喂養(yǎng)高脂飼料4周，每日灌胃生理鹽水2 mL/100 gmb。

PC組：繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，同時(shí)給予4 mg/kg辛伐他汀（辛伐他汀10 mg/片，溶于50 mL蒸溜水中，得0.2 mg/mL懸液），灌胃劑量為2.0 mL/100 gmb，每日1次，共喂養(yǎng)4周。

GRS2、GRS3、GRS4、HMS組：繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，同時(shí)分別灌胃GRS2、GRS3、GRS4、HMS淀粉懸濁液（0.125 g/mL），灌胃劑量為0.25 g/100 gmb，每日1次，共喂養(yǎng)4周。

淀粉灌胃劑量0.25 g/100 gmb是根據(jù)中國(guó)居民膳食指南中60 kg成人每日推薦膳食纖維攝入量20～35 g/d和其他抗性淀粉最佳劑量來(lái)確定的，如香蕉抗性淀粉等[14]。

1.3.4 體質(zhì)量和臟器指數(shù)的測(cè)定

在造模開(kāi)始時(shí)（第1周）、給藥前（第3周）和給藥后（第7周），分別測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量。4周給藥處理結(jié)束后，處死大鼠時(shí)，迅速分離肝臟、腎臟、脾臟、胸腺及心臟，用生理鹽水漂洗后，再用濾紙吸干表面水分，稱(chēng)質(zhì)量。臟器指數(shù)計(jì)算如公式（1）所示。

1.3.5 大鼠血脂指標(biāo)的測(cè)定

各組大鼠喂養(yǎng)2周后，禁食12 h但不禁水，眼眶取血1 mL置于裝有肝素鈉的離心管中，血樣送解放軍四七六醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定血脂各項(xiàng)指標(biāo)（包括TG、TCHO、HDL-C、LDL-C濃度）。實(shí)驗(yàn)期間，每日稱(chēng)體質(zhì)量1次，調(diào)整給藥量。第7周處死時(shí)，取腹主動(dòng)脈血清0.5 mL置于離心管中，血液標(biāo)本送解放軍四七六醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定血脂指標(biāo)。

1.3.6 血管病理學(xué)觀察

取主動(dòng)脈上端約1 cm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織切片技術(shù)，固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中，主動(dòng)脈組織固定7 d后，進(jìn)行石蠟包埋，制作組織切片及HE染色，HE染色流程參照Z(yǔ)eng Hongliang等[15]的方法進(jìn)行，用于血管病理學(xué)觀察。

1.3.7 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

制作結(jié)腸組織切片厚度為2～3 mm，將固定好的結(jié)腸組織用無(wú)菌水清洗后，分別經(jīng)70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）、80%、90%、100%乙醇梯度脫水1 h，脫水后在乙醇和二甲苯混合液（1∶1，V/V）中浸泡40 min，再放置于二甲苯中浸泡40 min。待組織透明后立刻浸蠟，在52～54、54～56 ℃和56～58 ℃ 3種不同熔點(diǎn)的石蠟中各處理2 h。待蠟塊接近凝固后放入水中加速凝固，修理、切片，約厚5～6 μm。結(jié)腸組織切片的染色和觀察參照黃燦燦[16]的方法進(jìn)行。

1.3.8 肝臟組織病理學(xué)觀察

大鼠解剖取肝臟后，取面積約為0.5 cm厚度為4 μm的組織用生理鹽水清洗干凈，在清洗后用吸水紙將殘留液擦干后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛進(jìn)行固定，密封過(guò)夜，然后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、貼片、HE染色和固封等處理后制作肝臟組織切片。光學(xué)顯微鏡下從低到高倍數(shù)進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)觀察。

1.3.9 血清膽汁酸靶向代謝組學(xué)測(cè)定

1.3.9.1 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精確稱(chēng)取膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加甲醇溶解并定容至1 mL，漩渦混勻，即可得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。

取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液各10 μL，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋至1 mL，得10 000 ng/mL工作液；再逐步稀釋得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL工作液，裝入1.5 mL的離心管中，待用。

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)，具體參數(shù)如下：色譜條件：LC30A色譜儀，Waters BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm、1.7 μm），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。流動(dòng)相A（0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸-水溶液），流動(dòng)相B（0.1%甲酸-乙腈）。質(zhì)譜條件：QTRAP 6500+質(zhì)譜儀，采用負(fù)離子模式檢測(cè)，氣簾氣為35，噴撞氣為中等強(qiáng)度，離子化電壓為－4 500 V，溫度為500，噴霧氣為40，輔助加熱氣為50。標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖如圖1所示。

圖1 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of bile acid standards

以目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的R2均大于0.99，說(shuō)明方程線性良好。

表1 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程Table 1 Linear calibration equations for bile acid standards

1.3.9.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)膽汁酸

精確移取100 μL血清樣本，加入400 μL甲醇，漩渦混勻30 s，低溫超聲30 min（5 ℃、40 kHz），－20 ℃靜置30 min，在4 ℃條件下13 000×g離心15 min，取上清液200 μL上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性定量檢測(cè)，色譜與質(zhì)譜參數(shù)條件同1.3.9.1節(jié)。色譜流動(dòng)相梯度如表2所示，流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈。

表2 液相色譜檢測(cè)膽汁酸的流動(dòng)相梯度Table 2 Gradient mobile phase program for liquid chromatography of bile acids

1.3.9.3 膽汁酸質(zhì)量濃度的計(jì)算

在定量軟件SCIEX OS中采用默認(rèn)參數(shù)對(duì)各離子碎片進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和積分，并輔助人工檢查。以分析物的質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)，以分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品分析物的質(zhì)譜峰面積，代入線性方程中，計(jì)算上樣溶液中膽汁酸的質(zhì)量濃度。血清中的膽汁酸質(zhì)量濃度計(jì)算如公式（2）所示。

式中：ρ為上機(jī)測(cè)定的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V1為定容的體積/mL；V2為取樣體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用CaseViewer成像軟件和圖像分析系統(tǒng)定量分析血管、結(jié)腸、肝臟的染色組織切片。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。采用OriginPro 8.5及GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血癥大鼠模型的建造

高脂飼料喂養(yǎng)2周后大鼠的血脂指標(biāo)如表3所示，相對(duì)于正常飼料喂養(yǎng)組，高脂飼料組的大鼠TG、TCHO和LDL-C濃度顯著增大（P＜0.05），而高脂飼料組大鼠血脂指標(biāo)HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）。這表明采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠2周后可成功造成高脂血癥大鼠模型，這與金柑多糖降血脂機(jī)制中高脂血癥大鼠的造模結(jié)果[15]一致。

表3 高脂飼料喂養(yǎng)兩周對(duì)大鼠血脂指標(biāo)的影響Table 3 Effect of high-fat diet feeding for two weeks on lipid profile in rats

2.2 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響

生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響如表4所示，造模開(kāi)始時(shí)，各適應(yīng)性喂養(yǎng)1周的大鼠的體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，體質(zhì)量均在130 g左右。采用高脂飼料喂養(yǎng)2周后，給藥前的高脂血癥大鼠的體質(zhì)量顯著高于NC組的大鼠體質(zhì)量（P＜0.05），而HM、PC、GRS2、GRS3、GRS4組和HMS組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異。經(jīng)過(guò)4周的灌胃辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS，各組大鼠體質(zhì)量均高于NC組大鼠；相對(duì)HM組，PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），其中，PC組和GRS4組大鼠體質(zhì)量最小，且兩組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這表明生姜抗性淀粉能顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量，該結(jié)果與RS2型香蕉抗性淀粉[17]、RS3型鷹嘴豆抗性淀粉[18]和RS4型甘薯抗性淀粉[19]對(duì)高脂血癥動(dòng)物體質(zhì)量影響結(jié)果一致，抗性淀粉可在一定程度上控制高脂動(dòng)物的體質(zhì)量增長(zhǎng)。

表4 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effect of ginger resistant starch on body mass in hyperlipidemic rats

2.3 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠臟器指數(shù)的影響

生姜抗性淀粉對(duì)高血脂癥大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺和心臟等臟器指數(shù)的影響如表5所示，經(jīng)過(guò)4周的給藥處理，各組大鼠的腎臟和心臟的臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。相對(duì)于HM組大鼠，灌胃4周辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能顯著降低大鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.05），PC組和GRS4組效果最佳，這表明高脂飼料會(huì)損害大鼠的肝臟，使之出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，而生姜抗性淀粉可在一定程度上減輕大鼠的脂肪肝損傷，該結(jié)果與大米抗性淀粉對(duì)高脂小鼠肝臟指數(shù)影響的結(jié)果[20]一致。就脾臟指數(shù)來(lái)說(shuō)，HM組大鼠顯著高于其他組大鼠，NC和PC組大鼠脾臟指數(shù)最低，且兩者無(wú)顯著差異；生姜抗性淀粉組及HMS組之間無(wú)顯著性差異。NC組大鼠的胸腺臟器指數(shù)最低，其他組之間無(wú)顯著差異。這表明高脂飼料喂養(yǎng)會(huì)在一定程度上損害大鼠的免疫器官。

表5 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠臟器指數(shù)的影響Table 5 Effect of ginger resistant starch on visceral organ indexes of hyperlipidemic rats

2.4 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血脂指標(biāo)的影響

生姜抗性淀粉對(duì)高血脂癥大鼠血脂指標(biāo)的影響如表6所示，相對(duì)于HM組，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低大鼠血清的TG和TCHO濃度（P＜0.05），且3種生姜抗性淀粉組大鼠的TG和TCHO濃度均顯著小于HMS組大鼠，這表明生姜抗性淀粉能降低高脂血癥大鼠的血脂水平，尤其是GRS3和GRS4的效果最佳。HDL-C能將外周組織如血管壁內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行分解代謝，即膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，可減少膽固醇在血管壁的沉積[15]。由表6可知，PC、生姜抗性淀粉和HMS組大鼠的HDL-C濃度顯著高于HM組大鼠，且顯著高于NC組，這與其他抗性淀粉對(duì)大鼠血清HDL-C濃度的影響不一致，比如甘薯抗性淀粉組的HDL-C濃度低于NC組[21]。HDL-C可以將身體的膽固醇運(yùn)輸?shù)缴眢w各個(gè)器官，來(lái)提高身體免疫力，防止動(dòng)脈出現(xiàn)硬化的情況[22]。Zanoni等[23]發(fā)現(xiàn)在SCARB1基因缺失的人群中，雖然HDL-C濃度顯著高于正常人，但他們患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)比常人更高，缺失了這個(gè)基因的人群無(wú)法利用HDL-C從外周運(yùn)輸來(lái)的膽固醇，機(jī)體為了代償而產(chǎn)生更多HDL-C，以將更多的外周膽固醇運(yùn)回肝臟。但事實(shí)是，產(chǎn)生更多的HDL-C也無(wú)法將外周膽固醇運(yùn)回肝臟并代謝掉。因此，適當(dāng)濃度水平的HDL-C才有益機(jī)體健康[24]。相對(duì)于HM組，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低大鼠的LDL-C濃度，尤其是PC組大鼠的LDL-C濃度最低，這是因?yàn)樾练ニ∈峭ㄟ^(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶降低LDL-C濃度的他汀類(lèi)藥物[25]。LDL-C則會(huì)把攜帶的膽固醇堆積在動(dòng)脈壁上[26]，含量過(guò)高會(huì)引起動(dòng)脈硬化，生姜抗性淀粉能夠降低這種風(fēng)險(xiǎn)。

表6 生姜抗性淀粉對(duì)高血脂癥大鼠血脂指標(biāo)的影響Table 6 Effect of ginger resistant starch on blood lipid indexes in hyperlipidemic rats

生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠ALT和AST活力的影響如圖2所示，PC、GRS2、GRS3、GRS4組及HMS組大鼠血清AST、ALT含量均顯著低于HM組（P＜0.05）。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、中毒、壞死等時(shí)會(huì)造成肝細(xì)胞的受損，轉(zhuǎn)氨酶便會(huì)釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高[27]。動(dòng)物體內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)氨酶為ALT和AST，二者活力都是肝功能測(cè)試的重要指標(biāo)。生姜抗性淀粉可以降低血清中ALT和AST的活力，這說(shuō)明生姜抗性淀粉可以減輕肝臟損傷。

圖2 生姜抗性淀粉對(duì)高血脂癥大鼠AST活力（A）和ALT活力（B）的影響Fig. 2 Effect of ginger resistant starch on the activities of AST (A) and ALT (B) in hyperlipidemic rats

2.5 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血管病理學(xué)影響

高脂血癥大鼠心臟動(dòng)脈血管病理學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，NC組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)且完整，血管層次清楚；內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮下未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及脂質(zhì)性物質(zhì)；中層及血管外模結(jié)構(gòu)完整清晰，未見(jiàn)組織細(xì)胞脫落；血管中膜層菱形平滑肌細(xì)胞排列整齊，存在少量的纖維成分，未見(jiàn)脂肪細(xì)胞（圖3A）。HM組大鼠血管內(nèi)膜增厚并在血管內(nèi)呈現(xiàn)隆起、折疊狀態(tài)；血管外壁組織細(xì)胞松散脫落，細(xì)胞間隙增寬（圖3B紅色箭頭）；血管內(nèi)膜中存在水腫現(xiàn)象，有水泡狀細(xì)胞浸潤(rùn)；血管中膜層存在大量圓形泡狀脂肪細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)增生，細(xì)胞生長(zhǎng)排列紊亂且穿透內(nèi)膜生長(zhǎng)并向血管內(nèi)膜遷移；血管組織形態(tài)發(fā)生病變（圖3B）。PC組大鼠血管組織形態(tài)經(jīng)藥物灌胃得到有效改善，血管層次、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及血管外壁較HM組有所改善。以上結(jié)果與金柑多糖對(duì)高脂血癥大鼠血管病理學(xué)影響的結(jié)果[15]一致。GRS2組和HMS組中可見(jiàn)少量圓形泡狀脂肪細(xì)胞（圖3D、G紅色箭頭），其泡狀脂肪細(xì)胞明顯少于HM組（圖3C）。經(jīng)生姜抗性淀粉GRS3、GRS4組灌胃后的高脂血癥大鼠血管狀態(tài)均有不同程度的改善，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)且完整，血管層次清楚（圖3E、F），且生姜抗性淀粉效果優(yōu)于HMS。

圖3 高脂血癥大鼠血管病理學(xué)觀察結(jié)果Fig. 3 Observation of vascular pathology in hyperlipidemic rats

2.6 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

大鼠結(jié)腸位于右髂窩內(nèi)，續(xù)于盲腸，在第3骶椎平面連接直腸，由升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸4 段組成，結(jié)腸大部分固定于腹后壁[28]。結(jié)腸橫切面由內(nèi)到外依次為：黏膜（包括上皮層、固有層、黏膜肌層）、黏膜下層（為疏松的結(jié)締組織）、肌層（為內(nèi)環(huán)形、外縱行兩層平滑肌）和外膜（包括纖維膜或漿膜）[29]。生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)的影響如圖4所示，NC組大鼠結(jié)腸肌層厚，組織結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞排列整齊；結(jié)腸絨毛在結(jié)腸內(nèi)呈折疊狀態(tài)整齊排列，絨毛與黏膜連接緊密（圖4A箭頭）。HM組大鼠結(jié)腸肌層較NC組薄，基層外表面組織結(jié)構(gòu)松散，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，結(jié)腸絨毛稀疏，僅在結(jié)腸內(nèi)表面附著，結(jié)腸內(nèi)空間空洞（圖4B方框和箭頭），由此可知，高脂膳食破壞了大鼠結(jié)腸黏膜層的完整性，對(duì)結(jié)腸結(jié)構(gòu)造成了損傷。PC組大鼠結(jié)腸肌層、黏膜及絨毛狀態(tài)均有所改善（圖4C箭頭）。經(jīng)生姜抗性淀粉GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血癥大鼠結(jié)腸狀態(tài)較HM組有明顯改善，結(jié)腸組織隱窩和杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，其肌層厚度、黏膜厚度及絨毛長(zhǎng)度增加（圖4D～F箭頭）。HMS組大鼠結(jié)腸組織有一定的程度的損傷，結(jié)腸內(nèi)容出現(xiàn)了糜爛（圖4G方框），杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且結(jié)構(gòu)不清晰，基底層變薄，絨毛長(zhǎng)度變短（圖4G箭頭）。

圖4 高脂血癥大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察Fig. 4 Histopathological observation of colon tissue in hyperlipidemic rats

通過(guò)CaseViewer圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組大鼠結(jié)腸肌層厚度、黏膜厚度和絨毛長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖5所示，生姜抗性淀粉組和PC組大鼠的結(jié)腸肌層厚度、結(jié)腸黏膜厚度和結(jié)腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于HM組大鼠，且生姜抗性淀粉GRS3對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜和肌層的保護(hù)效果最好。其原因可能是生姜抗性淀粉的添加調(diào)節(jié)了結(jié)腸腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，改變腸道微環(huán)境，使結(jié)腸絨毛長(zhǎng)度及狀態(tài)得到保護(hù)，提高了結(jié)腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而改善了結(jié)腸肌層及黏膜狀態(tài)，使結(jié)腸的功能得到顯著提高。該結(jié)論與薏苡仁抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)影響的結(jié)果[30]一致。

圖5 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)的影響Fig. 5 Effect of ginger resistant starch on colonic morphology in hyperlipidemic rats

2.7 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟組織病理學(xué)影響

高脂血癥大鼠肝臟病理學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果（放大100 倍）如圖6所示，NC組大鼠肝臟組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰并呈多邊形，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央形狀呈圓形，細(xì)胞質(zhì)豐富清澈，肝索以中央靜脈為中心成放射狀向四周排列（圖6A方框）。HM組大鼠均出現(xiàn)了一定的肝細(xì)胞代謝病變，大鼠肝臟小葉輪廓不清晰，肝細(xì)胞著色較正常細(xì)胞著色淺，胞漿顏色淺淡，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了大小不等的圓形脂肪空泡（圖6B箭頭），肝細(xì)胞體積較正常肝細(xì)胞變大變圓，細(xì)胞核偏離細(xì)胞中心而被擠在細(xì)胞邊緣，肝竇明顯變窄或消失，腺泡內(nèi)多見(jiàn)點(diǎn)狀或灶狀壞死，匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，并見(jiàn)明顯的肝纖維化，肝小葉中央靜脈周顯現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。PC組大鼠的肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞質(zhì)中的脂肪泡的數(shù)量較HM組明顯減少（圖6C箭頭），肝細(xì)胞染色加深，細(xì)胞水樣病變顯現(xiàn)消失，細(xì)胞核回歸細(xì)胞中心位置，肝細(xì)胞腺泡病變壞死現(xiàn)象消失；GRS2組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞質(zhì)中的脂肪泡大小及數(shù)量較HM組明顯減少（圖6D箭頭），肝細(xì)胞著色深，肝臟小葉輪廓清晰，細(xì)胞核未見(jiàn)偏離細(xì)胞中心，肝臟病變現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)。GRS3組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞質(zhì)中僅見(jiàn)少量脂肪泡（圖6E箭頭所示），肝臟小葉輪廓清晰，肝竇形狀未見(jiàn)變窄，肝臟病變好轉(zhuǎn)。GRS4組（圖6F）大鼠肝臟病變現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞質(zhì)中未見(jiàn)圓形脂肪泡，肝匯區(qū)炎癥現(xiàn)象消失，肝細(xì)胞著色深，肝臟小葉輪廓清晰。HMS組大鼠肝細(xì)胞病變現(xiàn)象稍有好轉(zhuǎn)，細(xì)胞質(zhì)中仍可見(jiàn)一定數(shù)量的圓形脂肪空泡（圖6G箭頭）。以上結(jié)果與紫花蕓豆抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟及腸屏障損傷的修復(fù)作用中肝臟病理學(xué)觀察結(jié)果[31]一致。結(jié)果表明，對(duì)大鼠長(zhǎng)期進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，經(jīng)過(guò)消化吸收后的一部分脂肪進(jìn)入肝臟，脂肪進(jìn)入肝臟后貯存并形成脂肪肝，造成肝臟的一系列病變。經(jīng)GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血癥大鼠，其肝臟細(xì)胞質(zhì)中的脂肪空泡數(shù)量較HM組明顯減少，脂肪空泡明顯變小，3種生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟保護(hù)作用較HMS的效果好。

圖6 高脂血癥大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察Fig. 6 Histopathological observation of liver tissue in hyperlipidemic rats

2.8 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清初級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響

采用靶向代謝組學(xué)技術(shù)測(cè)定25種膽汁酸，其中，初級(jí)膽汁酸10種、次級(jí)膽汁酸15種。生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清初級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響如圖7所示，各組中游離型初級(jí)膽汁酸（膽酸、鵝脫氧膽酸、β-鼠膽酸和α-鼠膽酸）質(zhì)量濃度明顯高于結(jié)合型初級(jí)膽汁酸（牛磺膽酸、牛磺-α-鼠膽酸、牛磺-β-鼠膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸）質(zhì)量濃度，這表明，大鼠血清中主要以游離型初級(jí)膽汁酸為主[32]。生姜抗性淀粉組大鼠血清中游離型初級(jí)膽汁酸整體上顯著低于HM組大鼠，尤其是GRS3和GRS4組大鼠，這與生姜抗性淀粉對(duì)高血脂癥大鼠血脂指標(biāo)影響的結(jié)果一致。PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中牛磺膽酸、牛磺-α-鼠膽酸、甘氨膽酸等結(jié)合型初級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異。PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中牛磺-β-鼠膽酸質(zhì)量濃度均顯著低于HM組大鼠，而GRS4和HMS組大鼠的牛磺鵝脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸卻顯著高于HM組大鼠，這可能與膽汁酸之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)[33]。以上結(jié)果表明，生姜抗性淀粉主要是通過(guò)降低血清中的游離型初級(jí)膽汁酸來(lái)調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂代謝。

圖7 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清初級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of ginger resistant starch on serum primary bile acid contents in hyperlipidemic rats

2.9 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清次級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響

生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清次級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響如圖8所示，高脂血癥大鼠血清中主要含有脫氧型次級(jí)膽汁酸，如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸、鼠脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸和甘氨脫氧膽酸等，其中，豬脫氧膽酸和熊脫氧膽酸等游離型脫氧型次級(jí)膽汁酸的質(zhì)量濃度最高。相對(duì)于HM組，PC、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、ω-鼠膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸、別膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、豬膽酸、石膽酸和7-酮基石膽酸等質(zhì)量濃度整體上顯著降低，其中，GRS3、GRS4組和HMS組降低血清中上述次級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的效果最佳。而GRS2組大鼠血清中次級(jí)膽汁酸7-脫氫膽酸、鼠脫氧膽酸和熊果膽酸等質(zhì)量濃度高于HM組。GRS2能夠增加大鼠血漿中上述次級(jí)膽汁酸的質(zhì)量濃度，可能是因?yàn)槠淇捎绊懡Y(jié)腸中微生物組成和結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)肝腸軸中膽汁酸組成和質(zhì)量濃度的變化[34]。GRS3和GRS4主要降低大鼠血清中脫氧型次級(jí)膽酸（如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸和甘氨熊脫氧膽酸等）質(zhì)量濃度。

圖8 生姜抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠血清次級(jí)膽汁酸質(zhì)量濃度的影響Fig. 8 Effect of ginger resistant starch on serum secondary bile acid contents in hyperlipidemic rats

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，相對(duì)HM組，辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量和肝臟指數(shù)，辛伐他汀和GRS4效果最佳。辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低高脂血癥大鼠血清的TG、TCHO、LDL-C濃度，顯著降低ALT和AST活力，顯著提高HDL-C含量，GRS3和GRS4的效果最佳。由組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，GRS3和GRS4能改善高脂血癥大鼠血管層次、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及血管外壁結(jié)構(gòu)；增加結(jié)腸肌層厚度、黏膜厚度及絨毛長(zhǎng)度，使結(jié)腸組織隱窩和杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；減少肝臟細(xì)胞質(zhì)中的脂肪空泡數(shù)量和大小，且效果優(yōu)于HMS。此外，生姜抗性淀粉GRS3和GRS4能夠顯著降低血清中的游離型初級(jí)膽汁酸（如膽酸、鵝脫氧膽酸、β-鼠膽酸和α-鼠膽酸）和脫氧型次級(jí)膽酸（如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸和甘氨熊脫氧膽酸）的質(zhì)量濃度，GRS3和GRS4主要通過(guò)降低血清中的游離型初級(jí)膽汁酸和脫氧型次級(jí)膽酸含量來(lái)改善高脂血癥大鼠的血脂代謝。