苦瓜皂苷對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及其機制研究

白 娟，張金富，張佩熙，何林釗，武蓓琪，祝 瑩，李 潔，肖 香

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

衰老是機體的一種退化，主要表現為機體代謝功能與免疫調節能力的下降[1]。近年來，衰老相關疾病如代謝性和神經退行性等年齡相關退行性疾病，對中老年人的生活質量造成嚴重不良影響，給社會和家庭帶來沉重經濟負擔[2]。合理的抗衰老措施可預防或延緩某些老年病，延長壽命。目前關于衰老機制的研究提出了多種學說，包括自由基氧化應激學說、細胞凋亡學說、端粒學說、線粒體DNA損傷學說等[3]。機制之間相互作用，特別是在代謝水平[4]，但控制這些相互作用的機制在很大程度上仍不清楚。眾多研究證據表明，脂質代謝的變化是健康衰老的顯著特征[5]。在延緩衰老延長壽命的措施中，干預脂代謝是減緩衰老的關鍵組成部分。研究發現，脂質信號與衰老的相關性是一個未被充分探索的領域，具有促進健康和延長壽命的巨大可能性。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）（簡稱線蟲），是研究衰老的經典模式生物，其具有繁殖快、生命周期短、結構簡單、基因組完整、發育定型和成本低廉等眾多優勢。線蟲在進化上與哺乳動物高度保守，60%～80%以上的基因與人類疾病相關基因同源[6]。近年來，通過脂質信號分子干預線蟲壽命，成為研究延緩衰老的熱點。aak-2基因是線蟲體內能量調控器之一，參與脂肪水解、脂肪酸氧化、多不飽和脂肪酸合成等生理過程[7]。研究表明，與野生型線蟲相比，aak-2基因缺陷的線蟲壽命較短[8]。胰島素/胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）-1信號（insulin/IGF-1 signaling，IIS）通路是無脊椎動物到哺乳動物體內公認的調控壽命與脂代謝的重要途徑。其中，daf-2和age-1分別編碼線蟲唯一的胰島素/IGF-1受體和磷脂酰肌醇-3-OH激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K），這是IIS通路的兩個關鍵上游因子[9]。daf-2的下游核轉錄調控因子daf-16是哺乳動物FOXO的同源基因，可調控脂肪沉積與衰老：daf-16的過表達能夠促進脂質合成，誘導脂肪積累，引起線蟲的高脂表型；而daf-16缺陷型線蟲更易衰老，壽命短于野生型[10]。由此可知，線蟲脂質代謝與壽命之間存在密切關聯。

苦瓜（Momordica charantiaL.）是一種公認的藥食同源食品，富含活性多糖、多肽、皂苷、類黃酮等活性成分，常被用來減肥降脂和輔助治療糖尿病。皂苷作為苦瓜苦味成分主要來源，種類繁多，主要為三萜化合物（如苦瓜皂苷（bitter melon saponin，BMS）A、C、F1、I、K等）和類固醇類（如β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷、5,25-豆甾二烯醇-3-葡萄糖苷等）[11]。眾多研究發現，BMS具有公認的類似胰島素降血糖的特性[12]，其調控機制主要包括激活一磷酸腺苷激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和胰島素受體-1（insulin receptor-1，IRS-1），促進下游葡萄糖轉運子（glucose transporter 4，GLUT4）的轉運，升高胞內糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、細胞外信號調節激酶（extracellular-regulated kinase 1/2，ERK1/2）以及蛋白激酶（protein kinase，PK）Cζ/λ的含量等[12-13]。此外，苦瓜三萜皂苷還可通過下調3T3-L1前脂肪細胞過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated recep-tor，PPARγ）的表達，從而降低脂肪累積有效抑制前脂肪細胞分化并降低動物體內血脂水平，表現出明顯的降脂功效[14]。因此，基于脂代謝與健康衰老緊密相關的理論基礎，BMS的降脂作用是否對線蟲自然壽命產生影響，有待進一步探索。

綜上，本實驗以線蟲為模型，研究BMS對線蟲生長、運動能力、脂肪沉積以及壽命的影響，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測脂代謝相關基因的mRNA表達水平，并利用脂代謝相關基因缺失的線蟲突變株，經壽命評估，建立BMS調控線蟲壽命與脂代謝的相關性，為脂質代謝與壽命之間的飲食調節機制提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

N2線蟲和大腸桿菌OP50 東南大學王大勇老師課題組饋贈；aak-2(ok524)X、daf-16(mu86)、nhr-49(nr2041)、fat-5(tm420)V、fat-6(tm331)IV、fat-7(wa36)V、fat6(tm331)IV、fat-5(tm420)V、fat-7(wa36)、fat5(tm420)V、fat-6(tm331)IV、fat-7(wa36)V、atgl-1(tm3116)/hT2線蟲突變體 美國普渡大學Keehong Kim實驗室；苦瓜粉（粉體粒度≤105 μm）由江蘇大學食品與生物工程學院中心實驗室和鎮江市愛邦電子科技有限公司制備。

油紅O染色、甘油三酯（triglyceride，TG）和Bradford蛋白檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；TaKaRa MiniBEST通用RNA提取試劑盒、Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；2-脫氧-5-氟尿嘧啶核苷（floxuridine，FUDR） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余生化試劑購于國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JSZ6體式顯微鏡 江南永新光學儀器有限公司；Ci-L正置顯微鏡 日本Nikon公司；LRH-150生化培養箱上海一恒有限公司；FD-8真空冷凍干燥機 北京博醫康有限公司；TG18G離心機 金壇市醫療儀器廠；YM50滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-1D超凈臺 蘇州凈化設備有限公司；多功能酶標儀M200Pro上海天能科技有限公司；THZ-82B搖床 金壇市醫療儀器廠；HPBM-1行星式球磨機 長沙米淇儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜皂苷的制備和含量測定

稱取苦瓜凍干粉100 g，按料液比1∶2（m/V）加入石油醚浸提12 h脫脂，倒去石油醚后再次按上述條件加入石油醚浸提12 h脫脂，倒去石油醚，待石油醚揮干后，加入1 L體積分數75%乙醇80 ℃回流提取兩次，收集濾液，用等體積的水飽和的正丁醇萃取3次，取正丁醇相50 ℃濃縮至呈褐色黏稠狀時冷卻，用100 mL無水甲醇溶解后加入100 mL丙酮充分攪拌使之產生沉淀，8 000 r/min離心15 min，所得沉淀用100 mL無水甲醇溶解后加入100 mL丙酮充分攪拌使之產生沉淀，8 000 r/min離心15 min，冷凍干燥得到BMS粗提物。

BMS中皂苷含量的測定：精確稱取干燥至恒質量的人參皂苷Rg1 5 mg，加甲醇定容至5 mL，搖勻，即得1 mg/mL的人參皂苷標準溶液。分別準確吸取標準溶液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL于具塞試管中，60 ℃水浴揮去溶劑，加入新制的50 g/L香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在60 ℃水浴中加熱15 min，流水冷卻后，加入5 mL冰乙酸，搖勻，放置20 min，測定550 nm波長處吸光度，以等體積甲醇作為空白對照。以人參皂苷Rg1質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。將BMS用甲醇溶解成1 mg/mL溶液按同樣方法測定吸光度，計算出BMS中皂苷的含量。

提取率測定：根據上述計算出BMS中皂苷的含量，占100 g苦瓜粉的比例，即為BMS的提取率（10.33%）。

1.3.2 線蟲培養與BMS處理

M9緩沖液配制：分別稱取磷酸二氫鉀3 g、磷酸氫二鈉6 g、氯化鈉5 g，移液槍吸取1 mol/L MgSO4溶液1 mL至燒杯中，加去離子水定容至1 L，高壓滅菌（121 ℃、20 min，后同）后分裝使用。S-basal溶液配制：分別稱取氯化鈉5.85 g、磷酸氫二鉀1 g、磷酸二氫鉀6 g，加去離子水溶解，定容至1 L，高壓滅菌冷卻后加入1 mL質量濃度為5 mg/mL的膽固醇溶液（用乙醇溶解）。S-complete溶液配制：分別取1L S-basal溶液、10 mL 1 mol/L檸檬酸鉀（pH 6）、10 mL微量金屬溶液、3 mL 1 mol/L氯化鈣、3 mL 1 mol/L硫酸鎂混勻。線蟲培養基的配制：分別稱取氯化鈉3 g 、蛋白胨2.5 g、瓊脂17 g，加去離子水定容至1 L，高壓滅菌，冷卻至60 ℃后加入1 mL 1 mol/L氯化鈣、1 mL 1 mol/L硫酸鎂、75 mL 1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6.0），最后加入1 mL質量濃度為5 mg/mL的膽固醇溶液（用乙醇溶解），以上混勻后倒平板。

線蟲用涂有大腸桿菌OP50的線蟲培養基在20 ℃培養箱中培養。

線蟲同步化處理：用2 mL M9緩沖液將處于產卵期的線蟲轉移至EP管中，離心（4 000 r/min、3 min，后同）棄去上清液，再加入2 mL M9緩沖液按上述方法清洗兩次。洗凈之后的線蟲1 mL加入裂解液（0.5 mol/L NaOH溶液和質量分數2.5% NaClO），漩渦振蕩。線蟲裂解充分后，離心棄上清液，用2 mL M9緩沖液清洗，清洗3次后將蟲卵轉移至20 ℃培養箱中孵育12 h得L1期幼蟲，備用。

BMS處理：根據BMS中皂苷含量，用少量甲醇復溶BMS凍干物，利用S-complete溶液配制皂苷質量濃度為10 mg/mL的母液，與大腸桿菌菌液混勻至終質量濃度為0（對照組）和50、100、200 μg/mL，涂布于L1期幼蟲線蟲培養基上供線蟲食用，在20 ℃培養箱中培養48 h。

1.3.3 油紅O染色

2 mL M9緩沖液收集BMS處理48 h后的線蟲（約1 000 條），4 000 r/min離心3 min棄去上清液，再加入2 mL M9緩沖液清洗3次。加入500 μL 體積分數60%異丙醇脫水固定，4 000 r/min 離心3 min，棄上清液；接著加入500 μL油紅O染色液，室溫避光振蕩6～18 h，4 000 r/min離心3 min，然后加入2 mL M9緩沖液清洗3次。最后加入250 μL 0.01%（體積分數）Triton-X100-M9緩沖液，立即在正置顯微鏡下拍照。

1.3.4 甘油三酯相對含量測定

BMS處理48 h后，用M9緩沖液洗線蟲3次，自然沉降，棄上清液。加入一定量M9緩沖液重懸，超聲破碎蟲體，5 000 r/min離心10 min，取上清液根據TG試劑盒說明書測定TG含量，蛋白質含量根據Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定。每組3個平行。各組TG含量與對照組的比值×100%即為TG相對含量。

1.3.5 線蟲基礎生理指標的測定

體長和體寬測定：BMS處理48 h后，隨機挑取30 條左右線蟲于500 μL M9緩沖液中，加入適量0.5 mol/L疊氮化鈉，待線蟲身體僵直后，蓋上蓋玻片。正置顯微鏡拍照，利用ImageJ軟件測定線蟲體長、體寬。

運動指標的測定：BMS處理48 h后，隨機挑取30 條左右線蟲于500 μL M9緩沖液中，測定頭部擺動頻率和身體彎曲頻率。頭部擺動頻率：記錄1 min內線蟲頭部擺動次數，挑取30 條左右線蟲于500 μL M9緩沖液中，滴于載玻片，于顯微鏡下計數（1個往返為擺動一次）；身體彎曲頻率：記錄1 min內線蟲身體彎曲次數，假設以咽泵的方向規定為y軸，在爬行過程中，線蟲身體沿著x軸方向完成1次正弦運動即為1次身體彎曲。每組30 條線蟲。

1.3.6 壽命評估

同步化L1幼蟲在線蟲培養基上經BMS處理48 h后，2 mL M9緩沖液洗3 遍，轉至S-complete緩沖液在Transwell培養板上中培養。加入終濃度120 μmol/L的FUDR以防線蟲產卵。每組約100 條線蟲，每隔2 d換新鮮培養液（含一定質量濃度BMS和120 μmol/L的FUDR的S-complete緩沖液），每隔1 d記錄線蟲數量，線蟲存活數量與初始線蟲總數的比值×100%即為線蟲存活率。采用OASIS（https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/surv/）在線分析程序對壽命曲線進行統計分析，得到線蟲的最長壽命，P值采用log-rank（Mantel-Cox法）確定。

1.3.7 實時熒光定量PCR

采用TaKaRa MiniBEST通用RNA提取試劑盒提取線蟲總RNA（每組約2 000 條）。利用Takara PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉錄生成cDNA，根據SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR操作，按照2－ΔΔCT方法處理數據，以act-1基因作為內參。引物由上海生工生物工程股份有限公司按標準設計并合成，引物序列如表1所示。

表1 線蟲脂代謝相關基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes involved in lipid metabolism in C. elegans

1.4 數據統計與分析

實驗結果用平均值±標準差表示。采用DPS軟件進行統計分析，采用單因素方差分析進行顯著性分析；用t檢驗比較組間差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BMS對線蟲脂肪沉積的抑制作用

為了確證本研究中BMS在線蟲體內抑制脂肪沉積的作用，首先通過油紅O和TG試劑盒檢測BMS對線蟲整體脂肪含量的影響。如圖1所示，與對照組相比，除50 μg/mL BMS處理外，100、200 μg/mL BMS處理均能明顯降低線蟲整體脂肪含量，使TG相對含量分別顯著降低28.60%和33.02%（P＜0.05）。體內外研究已指出，BMS具有明顯的降脂效果，如有效抑制前脂肪細胞分化、降低動物體內血脂水平[14-15]。其機制可能通過下調PPARγ的表達抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，降低脂肪酸脫飽和酶基因fat-5、fat-6、fat-7表達水平，抑制線蟲脂肪合成[16]。

圖1 不同質量濃度BMS對線蟲TG相對含量的影響Fig. 1 Effect of BMS at different concentrations on the relative content of TG in C. elegans

2.2 BMS對線蟲體長、體寬和運動能力的影響

在確證100、200 μg/mL BMS對線蟲脂肪沉積的抑制作用后，需進一步評估該質量濃度作用下是否對線蟲體長、體寬和運動能力等基礎生理指標有不利影響。由表2可知，BMS對線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率無明顯的改變，表明100、200 μg/mL BMS不影響線蟲的運動能力（P＞0.05）。研究表明，運動能力一定程度上反映能量消耗[17]。并且，BMS對線蟲的體長體寬基礎生理指標也無顯著影響（P＞0.05），說明BMS對線蟲的生長無抑制作用。由此可推斷，BMS緩解線蟲的脂肪累積并非通過抑制線蟲的生長發育，其機制可能與調節線蟲脂肪合成或脂肪酸氧化途徑密切相關[18]。

表2 BMS提取物對線蟲基礎生理指標的影響Table 2 Effect of BMS on basic physiological activities of C. elegans

2.3 BMS對野生型線蟲自然壽命的影響

為測定BMS對線蟲自然衰老的作用，本實驗采用液體培養法對線蟲壽命進行評估。由圖2和表3可知，與對照組（平均壽命為（21.14±0.35）d）相比，100、200 μg/mL BMS處理后的線蟲平均壽命分別為（23.39±0.33）d和（23.16±0.33）d，均能高度顯著延長野生型線蟲的壽命（P＜0.000 1），延緩其衰老?；?00 μg/mL和200 μg/mL BMS均有降脂和延長壽命的作用，因此，選取100 μg/mL BMS用于后期突變體的驗證實驗。已有大量研究發現，食品功能成分如白皮杉醇依賴IIS通路中核轉錄因子daf-16延長線蟲壽命[19]；菊苣酸通過抗氧化因子skn-1介導的分子途徑延緩線蟲的衰老[20]；三七多糖和齊墩果酸均可通過降低活性氧氧化應激延長線蟲平均壽命[21-22]。并且，最新研究報道表明，BMS可通過上調線蟲skn-1及其下游抗氧化基因（sod-3、sod-5、clt-1和clt-2）的表達，提高線蟲體內抗氧化活性，從而延長氧化應激下的壽命[23]。根據以上研究可知，現有的關于食品功能因子延壽抗衰老的機制研究主要集中在線蟲經典的IIS通路或抗氧化角度。然而，由于脂質代謝與壽命密切相關，BMS是否可通過抑制脂質沉積延長線蟲自然條件下的壽命，仍需進一步深入研究。

圖2 不同質量濃度BMS對線蟲壽命的影響Fig. 2 Effect of BMS at different concentrations on the lifespan of C. elegans

表3 BMS對野生型和突變型線蟲平均壽命的影響Table 3 Influence of BMS on survival rates of wild-type and mutant C. elegans

2.4 BMS延長線蟲自然壽命對IIS通路的依賴性

線蟲脂質代謝涉及的通路主要包括IIS通路和脂肪酸氧化、脂肪酸合成、脂肪分解通路等。本實驗采用實時熒光定量PCR技術分別對上述通路中關鍵基因的表達水平進行測定，篩選出BMS調控脂代謝的關鍵基因，為研究BMS延長壽命的機制提供實驗基礎。IIS通路參與調控線蟲體內能量穩態，其中daf-2是IIS通路中的上游分子，daf-2的激活誘導age-1的表達，繼而阻止daf-16的核易位，導致daf-16的磷酸化和失活[24]。如圖3所示，BMS對daf-2和daf-16基因表達均無顯著改變（P＞0.05），表明在轉錄水平BMS對IIS通路中關鍵因子daf-2和daf-16無明顯作用。

圖3 BMS對線蟲脂代謝調控基因表達的影響Fig. 3 Effect of BMS on expression levels of genes involved in lipid metabolism in C. elegans

由于分子調控過程包括轉錄、轉錄后以及翻譯水平的調控，因此本實驗利用daf-16基因缺陷型線蟲突變體，驗證BMS延長線蟲自然壽命對IIS通路的依賴性。由圖4A和表3可知，在daf-16突變體中，BMS并不能明顯延長突變體自然壽命，反而縮短了突變體的平均壽命（P＜0.000 1）。結合daf-2和daf-16基因的mRNA表達水平結果可得，BMS延長野生型線蟲的自然壽命不依賴于daf-16介導的胰島素信號通路。Peng Ye等也發現，菊苣酸具有延長野生型線蟲壽命的功能，而在攝食量相關基因eat-2突變體中卻表現出縮短線蟲壽命，表明菊苣酸延長壽命的作用不通過調節飲食的攝入量[20]。

2.5 BMS延長線蟲自然壽命對脂肪酸氧化通路的依賴性

在線蟲中，AMPK的亞基由aak-1和aak-2編碼，是細胞中的能量感受器，維持體內能量平衡。研究指出，AMP與ATP比例的增加可激活線蟲內一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated kinase-2，AAK-2），使得脂質代謝中關鍵酶磷酸化，從而促進脂肪分解代謝（脂解和脂肪酸氧化）或抑制脂肪酸、TG或膽固醇的合成代謝[25]。aak-2的下游基因主要參與脂肪酸氧化、脂肪合成與分解生理過程。從脂肪酸氧化角度，BMS略微增加aak-2和降低核轉錄因子nhr-49的基因表達量（圖3，P＞0.05），且對下游基因肉毒堿棕櫚酰轉移酶cpt1/cpt2、乙酰CoA合成酶acs-2的表達均無顯著改變，初步表明BMS可能對脂肪酸氧化通路無調控作用，但其確切的調控作用仍需在蛋白水平進一步明確。并且，在aak-2和nhr-49基因缺陷型突變體中，依然維持延長線蟲壽命的特性（圖4B、C和表3，P＜0.000 1）。結合兩部分結果顯示，BMS延長線蟲壽命與脂肪酸氧化通路無相關性。

BMS具有公認的類似胰島素降血糖的特性。Han等發現BMS組分可降低糖尿病小鼠血糖，其機制可能與BMS組分中三萜類化合物激活脂肪細胞AMPK通路，從而促進葡萄糖吸收有關[12]。且其他相關研究也指出，BMS是潛在的AMPK激動劑[26]。然而，本研究結果顯示，BMS對aak-2/AMPK的mRNA表達無影響?？紤]到轉錄后調控的作用，BMS可能對線蟲AAK-2蛋白的表達有影響，而本實驗未涉及到BMS降脂機制的深入研究。且圍繞本實驗的主題，aak-2基因的缺失確實不改變BMS延長壽命的功效，由此確證aak-2在BMS延壽過程中無調控作用。與Lin Chunxiu等的研究結果類似，BMS也對nhr-49下游乙酰CoA合成酶acs-2的表達無顯著改變，顯示BMS可能不通過脂肪酸氧化途徑調節脂代謝[16]。

2.6 BMS延長線蟲自然壽命對脂肪酸合成通路的依賴性

線蟲主要從其食物——大腸桿菌中外源性獲取脂肪酸，或者通過乙酰CoA內源性從頭合成脂肪酸，即乙酰CoA在各級脂肪酸合成酶催化下逐步轉化為磷脂酸、二?；视?，最終轉化為TG[27]。線蟲體內脂肪合成的關鍵步驟是單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）的合成，其中Δ9脂肪酸脫飽和酶（fatty acid desaturase，FAT）中的FAT-5、FAT-6和FAT-7發揮極為重要的作用。實時熒光定量PCR結果顯示（圖3），BMS顯著下調脂肪酸合成途徑中fat-5、fat-6和fat-7，以及調控Δ9脂肪酸脫飽和酶的核轉錄因子nhr-80的基因表達水平，提示BMS降脂的機制與抑制脂肪合成途徑密切相關。同樣，sbp-1與mdt-15也是fat-5、fat-6和fat-7的上游調控因子，但BMS對sbp-1與mdt-15的表達無顯著影響?；诖?，本實驗著重采用編碼Δ9脂肪酸去飽和酶的基因缺陷型線蟲，包括單突變體與多突變體，探究BMS延長線蟲自然壽命是否依賴性于Δ9脂肪酸去飽和酶介導的脂肪酸合成途徑。結果發現，在單基因缺陷型fat-5、fat-6和fat-7突變體，以及其雙突變體中，除fat5/fat6和fat5/fat7雙突變體外，BMS不能顯著延長線蟲自然壽命（圖4D～I和表3，P＞0.05），表明編碼Δ9脂肪酸去飽和酶的基因是BMS延壽作用中的必要基因。

FAT-5去飽和酶特異性作用于棕櫚酸（C16:0），而FAT-6和FAT-7主要使得飽和硬脂酸（C18:0）脫飽和，從而合成MUFAs。fat-5、fat-6或fat-7基因表達水平與TG水平呈正相關[28]。研究表明，參與脂肪酸去飽和過程的基因包括一些轉錄調節因子上調，如sbp-1（哺乳動物中SREBP-1的同源基因）、daf-16（IIS通路中daf-2的下游轉錄因子）、nhr-49和nhr-80（核激素受體基因）以及與nhr-49或sbp-1相結合的亞基mdt-15[29-30]。結合本實驗結果，在這些轉錄因子中，BMS僅對核激素受體nhr-80顯著下調，提示nhr-80在BMS調控脂肪酸合成中起關鍵作用。研究發現，nhr-80基因缺陷型突變體會顯著降低fat-5和fat-7的表達，并伴隨脂肪酸組成的變化，如18∶0與18∶1Δ9的比例。近期有研究報道稱，線蟲可通過fat-7提高不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFAs）與飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）的比例，增強線蟲在寒冷刺激下的耐受力，延長壽命。由此表明，Δ9脂肪酸脫飽和酶在維持線蟲UFAs與SFAs的平衡中發揮重要作用，并對線蟲壽命具有調控作用。因此在本研究中，BMS很大程度依賴Δ9脂肪酸去飽和酶介導的脂肪酸合成途徑，延長線蟲的自然壽命。其中，結合雙突變體壽命的驗證發現，僅fat-6/fat-7雙突變體在BMS的處理下壽命未延長，表明相比于fat-5，fat-6和fat-7在BMS延壽功效中的作用更加明顯，但其確切的作用機制可進一步通過脂質組學分析各類不飽和脂肪酸水平來驗證。

2.7 BMS延長線蟲壽命對脂肪分解通路的依賴性

脂質代謝過程主要包括脂肪的合成與分解。脂肪水解在提供能量方面起重要作用，涉及到復雜的信號級聯和連續酶激活反應。線蟲體內，脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）-1是脂肪水解過程中的關鍵脂肪酶。此外，激素敏感脂肪酶（hormonesensitive lipase homolog，HOSL）-1是多功能脂肪酶，能夠水解多種酰基酯，包括TG、二?；视秃蛦熙；视蚚31]。線蟲的脂肪水解過程中，ATGL-1和HOSL-1可水解90%以上的TG，且以ATGL-1為主。實時熒光定量PCR結果顯示，BMS對兩種脂肪酶的mRNA水平均無明顯的改變。并且，在atgl-1突變體內，BMS的延壽作用依然存在，表明ATGL-1的缺失對BMS延長線蟲壽命作用無影響。間接說明BMS延壽作用很大程度不依賴于ATGL-1介導的脂肪水解過程。

研究顯示，ATGL-1也被鑒定為應對禁食的關鍵脂肪酶。課題組前期研究發現，酯酰輔酶A∶膽固醇?；D移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）抑制劑Avasimibe，可通過ATGL-1促進線蟲在禁食條件下的脂肪水解提供能量，從而延長線蟲在禁食刺激下的壽命[6]。本研究表明，BMS延長線蟲自然壽命的作用與脂肪水解過程無相關性，可能缺失間歇或長期禁食的刺激。

3 結 論

本研究表明BMS在不影響線蟲生長發育前提下，具有緩解線蟲脂肪沉積，并延長自然壽命的功效。基于脂質代謝與壽命間的緊密聯系，本研究發現BMS的延壽作用很大程度上依賴于Δ9脂肪酸去飽和酶介導的脂肪酸合成途徑，繼而從脂代謝角度闡明了BMS延長線蟲自然壽命的分子機制。本研究結果可為BMS功能因子的研究和開發提供可靠的理論依據，但壽命調控機制錯綜復雜，仍有待繼續深入探究。