熱水處理促進胡蘿卜的愈傷

孔 蕊，柴秀偉，梁 偉，朱亞同，李寶軍，李永才，畢 陽,*，Prusky DOV

（1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.農業(yè)研究組織新鮮農產品采后科學部，以色列 里雄萊錫安 7505101）

胡蘿卜（Daucus carotaL. var. sativa Hoffm）是重要的園藝作物，世界各國普遍栽培。據聯合國糧食及農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，FAO）統計，2018年全世界年產蘿卜42 814 538 t，我國產量達20 574 774 t，占世界產量的近一半[1-2]。由于胡蘿卜根直皮薄，且多為機械采收，采收和采后處理期間極易對直根表皮造成機械損傷，致使其易受到以灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）為主的致腐病原菌的侵染[3]。

熱水處理是一種安全有效的采后處理方法，在控制果蔬采后病害、延緩成熟衰老并保持產品品質方面具有重要作用[4]。有研究表明，熱水處理可以通過激活苯丙烷代謝，提高H2O2含量和過氧化物酶活性，促進馬鈴薯塊莖傷口部位軟木脂和木質素的積累[5]。熱水處理可提高山藥活性氧和酚類物質代謝水平，促進切口部位木栓質快速形成，有效降低了腐爛率和質量損失率[6]。此外，熱水處理還可有效控制地下根莖類蔬菜的采后病害，例如，57.5 ℃熱水浸泡20 min可有效減輕由Fusarium sulphureum引起的馬鈴薯干腐病[7]，55 ℃熱水噴淋45 s可以有效抑制由Rhizopus stolonifer引起的甘薯軟腐病[8]。熱處理控制果蔬采后病害的機制除直接抑制或殺死病原菌外[9]，還可以激活苯丙烷代謝[10]，促進熱休克蛋白和病程相關蛋白積累，以及抗菌物質的合成[11]。盡管已有熱水處理促進馬鈴薯和山藥愈傷的報道，但熱水處理是否影響胡蘿卜采后愈傷鮮見報道。本實驗用熱水處理人工損傷的胡蘿卜，測定損傷胡蘿卜愈傷期間的質量損失率和病情指數，觀察聚酚軟木脂（suberin polyphenolic，SPP）和木質素在傷口處的積累，測定胡蘿卜傷口處的苯丙烷代謝關鍵酶活力以及產物含量。以期為熱水處理在胡蘿卜采后愈傷中的應用提供方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘新黑田五寸’胡蘿卜于2020年8月26日采自甘肅省金昌市永昌縣金玉宏蔬菜園，選取外觀良好、大小一致、無病蟲害、無機械損傷的胡蘿卜，立即裝入包裝箱，于當天運抵甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院采后生物學與技術實驗室，于常溫（（20±3）℃、相對濕度70%～80%）環(huán)境下貯藏備用。

供試灰葡萄孢霉（Botrytis cinereaPers.）由中國科學院植物研究所提供，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)待用。

無水乙醇、氯化鎂、乙酸、丙酮、硼酸、羥胺鹽酸、溴化乙酰 國藥集團化學試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、福林-酚 天津市光復精細化工研究所；甲苯胺藍上海中秦化學試劑有限公司；β-巰基乙醇、鹽酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、苯甲磺酰氟化物（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、交聯聚乙烯吡咯烷酮（polyvingypyrrolidone，PVPP 北京索萊寶科技有限公司；L-苯丙氨酸 上海凜恩科技發(fā)展有限公司；Triton X-100 北京酷來搏科技有限公司；4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）提取液 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋、THZ-100型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科技術有限公司；SPX-30085H-II型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HF036型刮皮刀 陽江市陽東區(qū)焦點刀具有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；CX21FS1C型生物顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司；1510型全波長酶標儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表公司；UV-2450型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Centri Vap真空離心濃縮儀 美國Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超快速液相色譜儀 美國Waters公司；BS-QT-013型微孔濾膜（0.22 μm） 美國Biosharp公司；CX21FSIC光學顯微鏡、CX21FS1C型熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 胡蘿卜損傷及熱水處理

胡蘿卜人工損傷參照Zhang Xuemei等[12]的方法并并適當修改。胡蘿卜清洗后用體積分數1%次氯酸鈉消毒2 min，蒸餾水沖洗，晾干，用消毒的刮皮刀在每個直根距離頂部與底部40 mm的部位削出2個50 mm×20 mm×1 mm的傷口，室溫下晾干。

熱水浸泡處理參照Yang Ruirui等[5]的方法。將上述損傷胡蘿卜放入裝有45 ℃熱水的恒溫水浴鍋中浸泡5 min（產品體積占總水分體積的比例小于10%），以20 ℃室溫自來水浸泡作為對照，取出自然晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋（30 cm×40 cm，厚0.02 mm），置于室溫（（20±3）℃、相對濕度70%～80%）黑暗條件下進行愈傷。于愈傷的第0、1、3、5、7天測定相關指標。前期預實驗發(fā)現，胡蘿卜在常溫條件下愈傷7 d即可實現完全愈傷，傷口處的愈傷組織不再明顯增加，故選擇在第7天結束實驗。

1.3.2 愈傷效果評價

1.3.2.1 質量損失率測定

采用稱質量法測定質量損失率，每個處理用胡蘿卜9個，重復3次。

1.3.2.2 病情指數測定

參照Yang Ruirui等[5]的方法并作修改。取培養(yǎng)了10 d的B. cinereaPDA平板，用滅菌的涂布器刮取孢子，經4 層紗布過濾后用血球計數板調節(jié)至濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液。分別在胡蘿卜愈傷的第0、1、3、5、7天，吸取上述配制好的孢子懸浮液20 μL接種于胡蘿卜傷口處。晾干后裝入打孔的聚乙烯保鮮袋，置于常溫（（20±3）℃、相對濕度70%～80%）避光條件下貯藏，接種7 d后統計各發(fā)病級別對應的胡蘿卜個數，并按下式計算病情指數。每個處理用胡蘿卜9個，重復3次。

式中：發(fā)病級別的標準分為5 級，其中：4級，75%＜傷口發(fā)病表面積比例≤100%；3級，50%＜傷口發(fā)病表面積比例≤75%；2級，25%＜傷口發(fā)病表面積比例≤50%；1級，0%＜傷口發(fā)病表面積比例≤25%；0級，傷口表面不發(fā)病。

1.3.3 聚酚軟木脂及木質素沉積觀察

SPP的沉積觀察參照Lulai等[13]的方法并修改。用不銹鋼刀片垂直傷口表面切成厚0.2～0.3 mm、長和寬均為1 cm左右的薄片，用蒸餾水沖洗切片表面，置于載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察切片的自發(fā)熒光并拍照。

木質素的沉積觀察參照Alba等[14]的方法并作適當修改。在垂直傷口表面切出厚度0.2～0.3 mm、長和寬均為1 cm左右的薄片，蒸餾水沖洗8 遍，置于載玻片上滴加1 g/100 mL間苯三酚及濃鹽酸染色1 min，置于光學顯微鏡下拍照觀察。

愈傷組織的SPP和木質素細胞層厚度根據Oirschot等[15]的方法通過IS Capture圖像軟件進行測量并計算。

1.3.4 生化指標測定時的樣品處理

參照韓占紅等[16]的方法并作修改。用滅菌的手術刀取傷口處3 mm深組織，液氮速凍后用研樣機研為粉狀，裝入50 mL離心管，－80 ℃保存待用。

1.3.5 酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的測定參照Koukol等[17]的方法并作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.8，含40 g/L PVP、0.2 mol/L EDTA、0.05 mol/Lβ-巰基乙醇），冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應體系包括0.5 mL粗酶液、3 mL硼酸-硼砂緩沖液（50 mmol/L，pH 8.8）和0.5 mLL-苯丙氨酸（0.02 mol/L），混合后以反應10 s時測定在290 nm波長處的吸光度，在37 ℃下水浴1 h后，再次測定在290 nm波長處的吸光度。蒸餾水為對照，以每小時吸光度變化度增加0.01為一個酶活力單位（U）。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力的測定參照Lamb[18]的方法并略作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL提取液（15 mmol/Lβ-巰基乙醇、50 mmol/L pH 8.9 Tris-HCl、4 mmol/L MgCl2、體積分數10%甘油、10 μmol/L亮抑酶肽、5 mmol/L VC、1 mmol/L PMSF、質量分數0.15% PVPP，冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。反應體系：2.2 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含 8 μmol/L反式肉桂酸、3 μmol/L NADPNa2、6 μmol/L 6-磷酸葡萄糖二鈉，pH 8.9）、0.8 mL 粗酶液。在340 nm波長處測定吸光度。以Tris-HCl緩沖液作為對照。以每小時吸光度變化增加0.01為一個酶活力單位（U）。

4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力的測定參照Voo等[19]的方法并作適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL提取液，冰浴條件下充分研磨。在4 ℃，10 000 r/min條件下離心30 min，上清液即為粗酶液。反應體系：0.45 mL 7.5 μmol/L Mg2+（硫酸鎂或氯化鎂）、0.15 mL 50 nmol/mLp-香豆酸、0.15 mL 2.5 μmol/mL ATP、0.15 mL 38 nmol/mL輔酶A以及0.5 mL粗酶液。40 ℃下反應10 min后，立即在333 nm波長處測定吸光度。以每分鐘吸光度增加0.001為1個酶活力單位（U）。

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力測定參照Goffner等[20]的方法并略作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL預冷的0.1 mmol/L pH 6.25的磷酸鹽緩沖液（含15 mmol/Lβ-巰基乙醇、2 g/100 mL聚乙二醇、0.1 g PVPP），冰浴條件下充分研磨。在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。反應體系：1.0 mL粗酶液、3 mL反應液（含10 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）、5 mmol/L反式肉桂酸），37 ℃水浴30 min，加入0.1mL 1 mol/L HCl終止反應（如有沉淀離心除去），以0.2 mL磷酸鹽緩沖液與0.8 mL反應液為對照，在340 nm波長處測定吸光度。每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Venisse等[21]的方法并略作修改。取冷凍粉末1.0 g，加入1 mL提取緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、質量分數4% PVPP、質量分數1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）），冰浴條件下充分研磨。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。反應體系：0.5 mL粗酶液、3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、200 μL 0.5 mol/L H2O2。以蒸餾水為對照，在470 nm波長處測定吸光度，每隔15 s記錄一次，連續(xù)測定2 min。以吸光度每分鐘變化0.01為一個酶活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/g，結果均以鮮質量計。

1.3.6 4種酚酸和3種木質素前體物質含量的測定

參照Ayaz等[22]的方法并作修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL體積分數70%甲醇，40 Hz條件下常溫超聲提取40 min，8 000 r/min離心30 min，重復2次并收集上清液，用真空冷凍濃縮儀于40 ℃旋轉蒸發(fā)。蒸干后，用1 mL體積分數70%甲醇復溶，過0.22 μm微孔濾膜備用。采用四元梯度超快速液相色譜分析，色譜條件：Waters Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；無水甲醇（A）和體積分數1%乙酸（B）為流動相，梯度洗脫程序：0～10 min、30% A+70% B，10～12 min、45% A+55% B，12～15 min、65% A+35% B，15～18 min、30% A+70% B，18～20 min、30% A+70% B，18～20 min、30% A+70% B；流速1 mL/min，進樣量10 μL。咖啡酸和芥子酸在325 nm波長處檢測，阿魏酸在322 nm波長處檢測，肉桂酸在276 nm波長處檢測，芥子醇和肉桂醇在273 nm波長處檢測，松柏醇在263 nm波長處檢測。以上物質含量單位均為μg/g，結果均以鮮質量計。

1.3.7 總酚、類黃酮和木質素含量的測定

總酚和類黃酮的測定參照Mullins等[23]的方法并作修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入5 mL體積分數0.5%乙酸與5 mL體積分數70%丙酮，置于低溫（4 ℃）黑暗環(huán)境24 h，8 000 r/min離心30 min，收集上清液為提取液。總酚含量測定體系：1 mL提取液、2 mL稀釋10 倍的福林-酚試劑、2 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3，5 min后在760 nm波長處測定吸光度，以無水甲醇為對照。類黃酮含量測定體系：0.5 mL提取液、0.2 mL 質量分數10% Al(NO3)3，常溫反應6 min，加入2 mL質量分數 4% NaOH溶液，反應15 min后，蒸餾水定容至5 mL。以無水乙醇為對照，在510 nm波長處測吸光度。總酚和類黃酮含量分別以每100 g鮮樣所含沒食子酸和兒茶酚質量計，單位μg/100 g。

木質素含量的測定參照Morrison等[24]的方法并做適當修改。稱取1.0 g冷凍粉末，加入5 mL預冷的體積分數95%乙醇溶液，10 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，沉淀物用體積分數95%乙醇溶液沖洗3 遍后再用V（無水乙醇）∶V（正己烷）=1∶2的混合溶液沖洗3次。置于高于50 ℃烘箱中干燥24 h，干燥物中加入1 mL質量分數25%溴化乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒溫水浴 30 min，加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸，4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液0.5 mL用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波長處測定OD值。木質素含量每克鮮組織的OD280nm表征。

1.3.8 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參照Prochazkova等[25]的方法并略修改。取1.0 g冷凍粉末，加入3 mL冷丙酮，冰浴磨成勻漿，于4 ℃下12 000r/min離心20 min，取上清液。反應體系：1 mL上清液、100 μL體積分數20%四氯化鈦溶液（溶劑為濃鹽酸）和200 μL濃氨水。混勻反應5 min后4 ℃下8 000 r/min離心15 min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4次以減少色素的干擾，最后將沉淀溶于1.5 mL 1 mmol/L H2SO4溶液中，于410 nm波長處測定溶液的吸光度。通過標準曲線方程計算H2O2含量，單位為μmol/g，結果以鮮質量計。

1.4 數據統計與分析

上述各項測定至少重復3次。全部數據用Excel 2010軟件計算平均值和標準差，用SPSS 19.0軟件進行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 熱水處理對胡蘿卜愈傷期間質量損失率和病情指數的影響

質量損失率和病情指數是評價愈傷效果的重要指標。愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜的質量損失率均持續(xù)升高，除第1天外，處理組的質量損失率顯著低于對照組，第5天時低于對照組21%（P＜0.05）（圖1A）。處理組和對照組胡蘿卜的病情指數隨愈傷時間的延長逐漸降低，處理組的病情指數顯著低于對照組，第3天時低于對照組22%（P＜0.05）（圖1B）。質量損失率和病情指數的結果表明，熱水處理組有效促進了胡蘿卜的愈傷。

圖1 熱水處理對愈傷期間損傷胡蘿卜質量損失率（A）和損傷接種胡蘿卜病情指數（B）的影響Fig. 1 Effect of hot water dipping on mass loss of wounded carrots (A)and disease index (B) of inoculated carrots during wound healing

2.2 熱水處理對胡蘿卜傷口處SPP和木質素積累的影響

SPP和木質素是傷口處愈傷組織的重要成分。愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜在傷口處的SPP、木質素積累量隨愈傷時間的延長逐漸增加，差異出現在第3天，之后處理組胡蘿卜的積累量均顯著高于對照組（圖2A、B）。處理組和對照組胡蘿卜在傷口處的SPP、木質素細胞層厚度隨愈傷時間的延長逐漸增加，其中處理組的SPP細胞層厚度在第3天高出對照組18%（P＜0.05），處理組的木質素細胞層厚度在第5天高出對照組16%（P＜0.05）（圖2C、D）。上述結果表明，熱水處理有效促進了胡蘿卜傷口處SPP和木質素的積累。

圖2 熱水處理對胡蘿卜傷口處SPP、木質素積累的影響Fig. 2 Effect of hot water dipping on the accumulation of SPP and lignin at wounded sites of carrots during healing

2.3 熱水處理對胡蘿卜傷口處苯丙烷代謝關鍵酶活力的影響

苯丙烷代謝的關鍵酶活性決定酚類物質的生成量。愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜傷口處的PAL活力前期迅速增加，第1天達到峰值后逐漸降低，處理組胡蘿卜的活力高于對照組，且在第1、3天具有顯著性差異，第1天時高出對照組31%（P＜0.05）（圖3A）。胡蘿卜傷口處的C4H、4CL和CAD活力在愈傷期間均呈先升高后降低的變化趨勢，在第3天達到峰值，且3 d后處理組整體上顯著高于對照組（P＜0.05）（圖3B～D）。上述結果表明，熱水處理激活了胡蘿卜傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD。

圖3 熱水處理對胡蘿卜傷口處PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig. 3 Effect of hot water dipping on the activity of PAL (A), C4H (B) ,4CL (C) and CAD (D) at wound sites of carrots during healing

2.4 熱水處理對胡蘿卜傷口處4種酚酸以及總酚、類黃酮含量的影響

肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸是SPP形成的前體物質。愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜的肉桂酸、總酚及類黃酮含量均逐漸上升，處理組胡蘿卜在愈傷中后期這些物質的含量均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖4A、E、F）。愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜的咖啡酸、阿魏酸與芥子酸含量均呈先升高后降低的趨勢，處理組胡蘿卜的含量高于對照組，且在中后期具有顯著性差異（P＜0.05）（圖4B～D）。上述結果表明，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸的含量，促進了總酚及類黃酮的積累。

圖4 熱水處理對胡蘿卜傷口處肉桂酸（A）、咖啡酸（B）、阿魏酸（C）、芥子酸（D）、總酚（E）和類黃酮（F）含量的影響Fig. 4 Effect of hot water dipping on the contents of ferulic acid (A),coffeic acid(B), ferulic acid (C), cinnamic acidsinapic acid (D), total phenolics (E) and flavonoids (F) at wound sites of carrots during healing

2.5 熱水處理對胡蘿卜傷口處3種木質素單體及木質素含量的影響

肉桂醇、松柏醇、芥子醇是木質素單體，愈傷期間，處理組和對照組胡蘿卜的肉桂醇、芥子醇及木質素含量均逐漸增加，處理組胡蘿卜的這3種物質含量在愈傷中后期均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖5A、C、D）。處理組和對照組胡蘿卜的松柏醇含量在愈傷期間呈先升高后降低的變化趨勢，處理組胡蘿卜的含量高于對照組，且在第1、3、7天具有顯著性差異，第3天時高出對照組26%（P＜0.05）（圖5B）。上述結果表明，熱水處理組提高了胡蘿卜傷口處肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質素含量。

圖5 熱水處理對胡蘿卜傷口處肉桂醇（A）、松柏醇（B）、芥子醇（C）和木質素（D）含量的影響Fig. 5 Effect of hot water dipping on the contents of cinnamyl alcohol (A),coniferyl alcohol (B), sinapyl alcohol (C) and lignin (D) at wound sites of carrots during healing

2.6 熱水處理對胡蘿卜傷口處H2O2含量和POD活力的影響

H2O2含量和POD活力可反映SPP和木質素單體的聚合水平。處理組胡蘿卜的H2O2含量在愈傷期間先上升后下降再上升，對照組胡蘿卜的H2O2含量在愈傷早期有所增加，后趨于平穩(wěn)。除第5天外，處理組胡蘿卜的H2O2含量顯著高于對照組（P＜0.05）（圖6A）。處理組和對照組胡蘿卜的POD活力在愈傷期間不斷增加，處理組顯著高于對照組，第1天時高出對照組1.75 倍（P＜0.05）（圖6B）。上述結果表明，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處的H2O2含量和POD活力。

圖6 熱水處理對胡蘿卜傷口處H2O2含量（A）和POD活力（B）的影響Fig. 6 Effect of hot water dipping on H2O2 content (A) and POD activity (B) at wound sites of carrots during healing

2.7 胡蘿卜各指標之間的相關性分析結果

為了驗證胡蘿卜愈傷過程中各指標間的關系，選取了具有代表性的質量損失率、病情指數、SPP細胞層厚度、木質素細胞層厚度、總酚和木質素含量6個指標，通過皮爾遜相關性分析來明確他們之間的關系。由表1可知，與胡蘿卜愈傷相關的6個指標間均呈極顯著相關（P＜0.01）。其中，質量損失率（r=0.904）、SPP細胞層厚度（r=0.928）及木質素細胞層厚度（r=0.945）與總酚含量呈極顯著正相關，這些指標與木質素含量也呈極顯著正相關（r分別為0.771、0.896、0.911）。而病情指數與總酚含量（r=－0.952）和木質素含量（r=－0.974）呈極顯著負相關。這些結果表明，熱水處理對促進損傷胡蘿卜的愈合具有重要意義，提高了損傷胡蘿卜對病原菌的抗性。

以上結果均為現象指標，應進一步研究愈傷相關通路（如文中提出的苯丙烷代謝）基因或蛋白水平變化結果，才更能闡釋熱水處理的加速愈合機制。

表1 胡蘿卜愈傷效果與總酚和木質素含量之間的關系Table 1 Relationship between wound healing indexes and the contents of total phenolics and lignin in carrots

3 討 論

本研究發(fā)現，熱水處理可有效降低損傷胡蘿卜愈傷期間的質量損失率（圖1A），該結果與熱水處理降低馬鈴薯愈傷期間質量損失率的結果[5]類似。熱水處理減少胡蘿卜質量損失的原因可能是處理組激活了苯丙烷代謝，促進了酚類物質的產生。而酚類物質是SPP和木質素的合成底物，隨著SPP與木質素在傷口表面的聚合，有效阻止了通過傷口的水分蒸騰[26]。此外，熱水處理還可通過融化表皮蠟質封閉部分氣孔來減少水分蒸騰[10]。本研究還觀察到，熱水處理有效降低了B. cinerea損傷接種胡蘿卜的病情指數（圖1B），該結果與熱水處理降低F. sulphureum損傷接種馬鈴薯塊莖的病情指數的結果[5]類似。有報道表明，熱水處理可以促進SPP與木質素在傷口表面積累，從而形成物理屏障有效阻止病原菌的侵入[26]。此外，熱水處理還可促進具有抗菌活性的多酚和類黃酮合成，激活熱休克蛋白及病程相關蛋白，從而抑制病原菌的生長和擴展[27]。

苯丙烷代謝在愈傷過程中具有重要作用，既可提供SPP和木質素形成的底物，又可形成具有抗菌和抗氧化功能的多酚和黃酮類物質[28]。PAL是苯丙烷代謝的關鍵酶和限速酶，參與第一步反應，將L-苯丙氨酸脫去氨基生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在C4H的作用下羥基化生成香豆酸，香豆酸可在香豆酸-3-羥基化酶作用下生成咖啡酸，咖啡酸通過氧甲基轉移酶作用生成阿魏酸，阿魏酸通過阿魏酸-5-羥基化酶羥基化生成5-羥基阿魏酸，后者再通過5-羥基阿魏酸-O-甲基轉移酶甲基化生成芥子酸[29]。這些酚酸會被4CL轉化成為相應的香豆酸-CoA、阿魏酸-CoA和咖啡酸-CoA，這些酚酸-CoA在肉桂酰輔酶A還原酶的催化下分別形成香豆醛、芥子醛和松柏醛[30]。然后CAD將這些醛類物質轉化成肉桂醇、松柏醇、芥子醇等木質素的底物[31]。本研究觀察到，熱水處理組激活了PAL、C4H、4CL和CAD（圖3A～D），促進了肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、總酚和類黃酮的合成（圖4A～F），以及肉桂醇、松柏醇與芥子醇的積累（圖5A～C）。該結果與熱水處理促進馬鈴薯傷口處總酚和類黃酮積累的結果[5]類似。有研究表明，桃果實在熱水處理組后會快速應激，PAL基因表達量迅速上升[32]。因此推測，熱水處理可能通過調控PAL在轉錄水平上的表達來促進酚類物質的合成。至于熱水處理組如何調控苯丙烷代謝尚有待進一步研究。

SPP和木質素是愈傷組織的主要成分。SPP主要由羥基肉桂酸、阿魏酸等酚酸通過酯鍵和醚鍵連接而成，具有抵抗病原菌侵染的作用[33]。木質素主要由松柏醇、芥子醇和肉桂醇通過碳-碳鍵、醚鍵和酯鍵聚合而成[34]。木質素在細胞壁沉積除可增加其強度、限制病原菌的侵入外，還可毒殺病原物[35]。本研究發(fā)現，熱水處理促進了胡蘿卜傷口表面SPP和木質素的積累（圖2），該結果與熱水處理促進山藥傷口處SPP和木質素積累的結果[6]類似。SPP和木質素單體的氧化交聯均需要POD和H2O2的參與[36]，本研究發(fā)現，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處H2O2含量（圖6A），該結果與熱水處理提高馬鈴薯傷口處H2O2含量的結果[5]類似。有研究表明，熱處理可提高表達水母發(fā)光蛋白的轉基因煙草細胞質中Ca2+濃度[37]。而Ca2+可以作為信號分子激活鈣依賴蛋白激酶（calciumdependent protein kinase，CDPK），CDPK磷酸化位于質膜的NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX），NOX轉移電子到O2生成O2－·，由于O2－·存活壽命較短，很快又被超氧化物歧化酶歧化成易存活的H2O2[38]。因此推測，熱處理組胡蘿卜傷口處的H2O2含量升高可能與熱處理組調節(jié)Ca2+水平激活NOX途徑有關，但其具體作用機理有待進一步研究。本研究還觀察到，熱水處理提高了胡蘿卜傷口處的POD活性（圖6B）。該結果與熱水處理促進山藥傷口處POD的積累結果[6]類似。有研究表明，熱處理可誘導葡萄果實Hsp70的基因表達，POD活性也隨之增加[39]。因此，推測熱處理提高胡蘿卜傷口處POD活性與熱處理組促進熱激蛋白相關基因的表達有關。

4 結 論

熱水處理可激活胡蘿卜傷口處的PAL、C4H、4CL和CAD，促進肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、總酚及類黃酮，以及肉桂醇、松柏醇、芥子醇和木質素的合成。此外，熱水處理還提高了胡蘿卜傷口處的H2O2含量和POD活性。胡蘿卜傷口處的酚酸和木質素單體在H2O2和POD的作用下氧化交聯，聚合形成的SPP和木質素在傷口表面不斷沉積，從而有效降低了胡蘿卜愈傷期間的質量損失率和損傷接種的病情指數，促進了胡蘿卜的采后機械損傷愈傷。