低濃度乙烯利結合1-甲基環丙烯處理對香蕉果實香氣合成的影響

朱孝揚，沈 玲，司振偉，侯選文，陳維信，陸旺金，李雪萍

（華南農業大學園藝學院，南方園藝產品保鮮教育部工程研究中心，廣東省果蔬保鮮重點實驗室，廣東 廣州 510642）

香蕉是世界上最重要的水果之一，是我國熱帶亞熱帶地區廣泛種植的特色水果，也是我國華南地區出口和北運的主要水果之一[1-2]。香蕉果肉中富含淀粉、糖、蛋白質、果膠、VA、VB、VC、VE和鈣、磷、鐵等礦物質[1]，營養價值高。香蕉，顧名思義，怡人的香氣是其顯著的特點，也正是因為香蕉具有良好的風味品質，一直深受人們的喜愛。

香蕉是典型的呼吸躍變型水果，在貯運過程中，香蕉釋放出大量的乙烯，出現呼吸高峰，內部組織發生一系列生理生化變化，具體表現為果皮由綠轉黃、揮發性風味物質產生、果肉軟化、含糖量增加、組織透性增加[3]。香蕉采收后，隨著香蕉的成熟衰老，耐貯藏性不斷下降，該特性嚴重制約了香蕉貯運保鮮，生產上香蕉在運銷過程中損失嚴重，可高達20%～30%或更多，嚴重影響了香蕉產業的經濟效益[4]。因此，研究延緩香蕉成熟衰老和延長貨架壽命的方法有重要的意義。

香蕉果實特有的香氣是其吸引消費者和增強市場競爭力的重要因素之一。隨著國際市場對水果品質的要求越來越高以及食品工業對天然風味物質需求的增加，果品香氣日益受到關注，已成為水果品質的重要研究領域之一[5-6]。果實的香氣物質不但和果實品質有關，而且與果實的采后生理、貯藏加工以及微生物活動等方面有密切關系，其種類和含量是表征果實采后貯藏及貨架壽命的重要指標之一[7-8]。影響果實香氣物質含量和種類的因素很多，包括品種、種植方式和栽培區域、果實的采收成熟度和采后處理方式及貯藏方式等等[8-9]。目前已知香蕉果實的香氣成分有230種以上，主要為酯類、醇類和羰化物等[10]。

1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）作為一種安全無毒的乙烯受體抑制劑，可顯著延緩果蔬的成熟衰老[11-12]，并已成功地在蘋果、花卉等園藝產品商業貯藏保鮮中應用。但是香蕉對1-MCP處理較敏感，如果1-MCP處理方法不當，可影響香蕉成熟時果皮的正常轉黃和抑制香蕉香氣物質的生成[11,13]，因此限制了1-MCP在香蕉貯藏保鮮中的應用。經過1-MCP處理的香蕉果實醇類物質含量大量增加，而相應的酯類物質含量減少[13]，1-MCP對果實風味的影響主要是抑制其芳香物質的形成，減少果實的揮發性物質總量[14]。1-MCP處理顯著抑制了粉蕉果實成熟過程中4種特征性酯類的生成，抑制了己醛與反-2-己烯醛的產生[7]。此外，1-MCP還會影響蘋果、油桃、獼猴桃果實香氣物質的形成[15-16]。高濃度1-MCP處理有效延緩了獼猴桃品質劣變，但是抑制了獼猴桃果味香氣物質特別是酯類物質的形成[17]。1-MCP處理延緩桃果實成熟衰老的同時，也改變了桃果實香氣物質代謝模式[18]。在藍莓果實的研究中也發現，1-MCP處理會顯著減少果實的香氣物質形成，而1-MCP結合乙烯利處理能夠消除1-MCP對香氣物質的影響[19]。本課題組前期研究發現，短時間乙烯利處理后再用1-MCP結合處理，可以有效消除香蕉果實轉色不均勻的后熟問題，也減輕了單獨1-MCP對香氣物質的抑制作用[11]，但其對香氣合成影響的相關機理尚不明確。本研究進一步探討1-MCP對香蕉果實香氣代謝的影響，為生產上延長香蕉果實貯藏壽命、提高貯藏品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試香蕉‘巴西’蕉（Musaspp. cv. ‘Brazil’）（7.5～8成熟），采自廣東省番禺市南沙區。

強力（二氧化氯清洗劑） 中國農業科學院中獸醫研究所藥廠；抑菌鮮（異菌脲） 江蘇快達農化股份有限公司；輝風百克（咪鮮胺） 江蘇輝豐生物農業股份有限公司；乙烯利 上海華誼集團華原化工有限公司；各標準品（色譜純）及所有分離用有機溶劑均為國產分析純，均購于上海生工生物工程技術服務有限公司；RNA LA PCRTM Kit (AMV) Ver 1.1、Agarose Gel DNA Purification Kit日本Takara公司；Invitrogen M-MLV逆轉錄酶試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Premix ExTaq II試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Trace氣相色譜-質譜（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Finnigan公司；G3900型氣相色譜儀 日本島津有限公司；ICS3000多功能離子色譜儀 美國Dionex公司；IQ5熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國伯樂有限公司；BILON96-II超聲波細胞粉碎機 上海比朗公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將采收的香蕉當天運回實驗室，蕉指落梳，并將每梳香蕉切分單個果指，用清水洗凈，放入2 g/L的強力中浸泡10 min，然后用濃度均為500 μL/L的抑菌鮮和輝風百克混合溶液浸泡1 min進行殺菌處理，取出晾干備用。將預處理后的樣品分為3組，每組120 根香蕉，分別進行如下處理：1）直接將果實放入密封罐中，密封16 h（對照）；2）用50 μL/L乙烯利溶液浸泡1 min，然后自然晾干，3 h后用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（乙烯利+1-MCP處理組）；3）直接用400 nL/L 1-MCP于密封罐中密封熏蒸16 h（1-MCP處理組）。所有處理均在（25±1）℃條件下進行，所有樣品處理完后裝入厚0.03 mm的防霧保鮮袋內，不封口，裝箱置于（25±1）℃條件下貯藏，處理組和對照組在貯藏第14天時取出，用800 μL/L乙烯利催熟，催熟溫度為（25±1）℃。各處理均設3個重復。定期監測果實成熟進程，取樣及測定揮發性物質的組分與含量。

1.3.2 果實香氣物質的測定

參考朱虹等[20]的方法，選用DVB/CAR/PDMS萃取頭提取香蕉果實揮發性物質。取香蕉果實中段的果肉，用榨汁機壓榨成細小顆粒，取5 g果肉于20 mL采樣瓶中，密封瓶蓋，將萃取頭插入瓶中頂空部分，與樣品表面保持1.5 cm距離，萃取溫度約為常溫，萃取25 min。每處理3個重復，結果取平均值。通過GC-MS技術將采集到的質譜圖在NIST譜庫搜索，與有關文獻進行核對，同時對峰面積進行歸一化定量，得到各組分的相對含量，再結合保留時間、質譜、實際成分和保留指數等參數確定香蕉果實中共有8種主要揮發性物質，分別為乙酸異丁酯、丁酸異戊酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯、乙酸乙酯、己醛、反-2-己烯醛以及乙醇。使用G3900型氣相色譜儀對這8種揮發性物質進行定量分析，建立GC外標，以標準樣品的保留時間對GC譜圖的組分峰定性，以峰面積表征各物質含量。

GC條件：25301-U SupelcoWax10極性毛細管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）；載氣He（99.99%），流速1.0 mL/min，氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度220 ℃，不分流，固相微萃取進樣熱解析脫附時間5 min。程序升溫：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min升溫至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/ min升溫至180 ℃，保持1 min。

1.3.3 香氣代謝相關酶活力的測定

1.3.3.1 脂氧合酶活力的測定

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力測定參考朱虹[21]的方法，取1 g果肉于研缽內，加入5 mL預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含體積分數1% Triton X100 和1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）），冰浴勻漿。然后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液（酶提取液）待測。3 mL的反應體系中含有：0.1 mol/L亞油酸鈉溶液0.2 mL、0.1 mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 6.0）2.7 mL和酶提取液0.1 mL。反應體系經30 ℃水浴5 min后加入2.4 mL無水乙醇終止反應，于234 nm波長處測定吸光度。每組實驗3次重復。

1.3.3.2 醇酰基轉移酶活力的測定

醇酰基轉移酶（alcohol acyltransferase，AAT）活力測定參考Pérez等[22]的方法。酶提取液的制備：稱取0.4 g果肉樣品，加入4 mL蛋白提取液（0.1 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液、體積分數0.1% Triton X-100、1 g/100 mL聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethephon diamine tetra-acetic acid，EDTA），冰浴提取20 min，12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶提取液。

AAT活力測定：反應液組成為：2.5 mL 5 mmol/L MgCl2溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液）、150 μL 5 mmol/L乙酰輔酶A溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液）、50 μL 200 mmol/L丁醇溶液（溶劑為0.5 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液）和150 μL酶提取液。將以上組分混合后放置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB），室溫下放置10 min，412 nm波長處比色，以不含酶提取液的反應液為空白。以每克鮮組織1 min內吸光度升高0.001為一個活力單位（U），單位為U/g。

1.3.3.3 乙醇脫氫酶活力的測定

參考Lara等[23]的方法進行酶提取液制備。取1 g果肉樣品液氮研磨，加入5 mL蛋白提取液（85 mmol/L pH 6.0嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）緩沖液、1 g/100 mL PVPP、5 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），25 000×g、4 ℃離心15 min，上清液即為酶提取液。乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活力采用試劑盒進行測定。以每分鐘催化產生1 nmol產物的酶量定義為一個酶活力單位（U），ADH活力單位為U/mg，結果以蛋白質量計。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析

RNA的分離采用熱硼酸法[24]。按照RNA LA PCRTM Kit（AMV）Ver 1.1試劑盒說明書提取香蕉果肉組織樣品的總RNA并合成cDNA第1鏈，貯存于－20 ℃。

根據從NCBI上獲得的各個基因的序列，設計熒光引物（表1），選取ACT1為內參基因[25]。按SYBR Premix ExTaqII試劑盒說明配制PCR體系，運行程序為：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環。測定其Ct值，用2－ΔΔCt計算各樣品各個基因的相對表達量。

表1 研究所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數據處理與分析

使用Excel 2007軟件對數據進行整理與統計分析，結果采用平均值±標準差表示。使用SigmaPlot 10.0軟件作圖。使用SPSS 13軟件對結果進行方差分析，具體采用鄧肯氏新復極差（Duncan’s multiple ranger test，DMRT）檢驗法進行差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著）。采用R軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 乙烯利結合1-MCP處理對香蕉采后果肉中揮發性物質的影響

本課題組前期研究發現，1-MCP處理顯著抑制了香蕉果實的香氣物質合成，乙烯利+1-MCP處理有效緩解了單獨1-MCP處理對香氣的影響[11]。反-2-己烯醛和己醛是香蕉綠硬期特征香氣物質。從圖1可以看出，與對照組相比，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理延緩了綠硬期特征香氣物質（反-2-己烯醛和己醛）的高峰出現，意味著乙烯利+1-MCP和1-MCP兩個處理都能明顯延緩香蕉的后熟，同時乙烯利+1-MCP處理組反-2-己烯醛和己醛含量在到達高峰之后快速下降，表明該組果實在催熟之后醛類很快地被轉化為其他香氣物質。對照組和乙烯利+1-MCP處理中己醛和反-2-己烯醛含量在整個貯藏期間在的變化趨勢相同，均先上升后下降。對照組中己醛和反-2-己烯醛的含量高峰都出現在第10天，然后急速下降；乙烯利+1-MCP和1-MCP處理組在催熟前（前14 d）兩個物質含量變化緩慢，催熟后上升較快；乙烯利+1-MCP處理組中兩種物質的含量高峰都出現在第18天，然后急劇下降；而1-MCP處理中兩種物質含量一直處于上升階段。3個組中兩種物質含量高峰出現時間不同，表明了3個組的香蕉成熟進程均不一致。

圖1 不同處理對香蕉綠硬時期特征揮發性物質含量的影響Fig. 1 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in green ripe bananas

從圖2可以看出，乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組在香蕉催熟后才有少量的酯類物質產生，乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組酯類物質含量上升更快，貯藏末期的含量更高。表明乙烯利+1-MCP處理組中首先乙烯結合香蕉中的乙烯受體，啟動乙烯信號通路。乙烯與1-MCP形成競爭能夠顯著減少1-MCP對香蕉后熟及其香氣帶來的不良影響。

圖2 不同處理對香蕉黃熟期特征揮發性物質含量的影響Fig. 2 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in yellow ripe bananas

前期的研究發現乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丁酸丁酯和丁酸異戊酯為香蕉果實的黃熟期特征揮發性化合物[8,10]。如圖2所示，黃熟期4種特征物質在各組表現如下：對照組中這4種物質在前10 d含量為0，乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組都是在催熟后才有少量的酯類物質產生，果實開始啟動成熟后，除乙烯利+1-MCP處理組的乙酸異戊酯含量在第18天有一個高峰外，這兩組4種酯類物質含量一直保持上升的趨勢，且乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組在催熟后能較快地產生這4種特征性酯類物質，在貯藏末期，除了乙酸異戊酯，乙烯利+1-MCP處理組其他3種特征性酯類物質含量高于1-MCP處理組。

乙醇和乙酸乙酯兩個物質是過熟期特征揮發性物質，產生這兩種物質代表香蕉進入了無氧呼吸階段和衰老階段。從圖3可以看出，兩種物質大量產生的時期都在貯藏末期，在此期間，3個組的香蕉都發生了很強的無氧呼吸；乙烯利+1-MCP處理和1-MCP處理延緩了香蕉進入衰老階段。對照組在第10天便有少量的乙醇產生，乙酸乙酯的產生出現在第12天，之后兩種物質含量一直上升；乙烯利+1-MCP處理組的乙醇和乙酸乙酯都產生于第14天，之后含量也持續上升；1-MCP處理組的乙醇和乙酸乙酯出現分別在第18天和第16天。在貯藏第20天，3組之間的乙醇含量無顯著差異，對照組和乙烯利+1-MCP處理組的乙酸乙酯含量有差異，但是差異相對較小，均顯著高于1-MCP處理組。總體來說，單獨1-MCP處理和乙烯利結合1-MCP處理都明顯延緩和抑制香蕉果實不同成熟期特征香氣物質形成，但乙烯利+1-MCP處理組與對照組相比各物質含量更接近，其香氣物質高峰值都明顯高于單獨1-MCP處理組。

圖3 不同處理對香蕉過熟期特征揮發性物質含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the contents of volatile substances in over-ripe bananas

2.2 乙烯利結合1-MCP處理對香蕉香氣代謝相關關鍵酶活力和基因表達的影響

2.2.1 LOX活力和基因表達的變化

LOX是香氣代謝中脂肪酸代謝途徑的重要酶。從圖4A可知，各組香蕉在貯藏過程中的LOX活力均先下降后上升，且在貯藏末期LOX活力明顯低于初期。對照組LOX活力低峰出現在第10天，此時LOX活力為0.37 U/g，乙烯利+1-MCP組和1-MCP處理組LOX活力低峰均出現在第16天，此時LOX活力分別為0.32、0.38 U/g，兩組之間無顯著差異。LOX活力變化趨勢和己醛、反-2-己烯醛含量的變化趨勢完全相反。

如圖4B所示，LOX基因在香蕉果肉中的表達量較低，對照組中，LOX基因表達量在貯藏的第10天急劇下降到很低水平，且此后表達量一直保持在低水平。乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組在貯藏的0～5 dLOX基因表達量急劇下降，第5天時顯著低于對照組。乙烯利+1-MCP處理組LOX基因表達量在0～10 d急劇上升，10 d后逐漸下降，后期與對照組差異不顯著。1-MCP處理組LOX基因表達量5～12 d上升，12～14 d下降，14～16 d上升，并在第16天達到高峰，且高于對照組的最高表達量，然后急劇下降到低水平，且在第20天時與其他兩組無顯著差異。

總體來說，單獨1-MCP處理和乙烯利結合1-MCP處理都在貯藏前期提高了LOX活力，貯藏后期抑制了其活力，同時延緩LOX基因表達高峰的出現，但不降低峰值。

圖4 不同處理對香蕉LOX活力（A）和LOX基因表達量（B）的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of LOX

2.2.2 乙醇脫氫酶活力和基因表達的變化

ADH是香氣代謝中氨基酸代謝途徑的中端酶，該酶的活力與醇類的含量緊密相關，能夠催化醛類物質轉化為乙醇，乙醇與乙酰輔酶A在AAT催化下形成乙酸乙酯。因此ADH也能夠為香蕉中的酯類物質的形成提供前體物質，也是香氣代謝的關鍵酶。如圖5A所示，對照組ADH活力在整個貯藏期間不斷上升，乙烯利+1-MCP處理組的ADH的活力在催熟前受到抑制，但催熟后ADH活力出現上升趨勢。1-MCP處理組活力低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組。貯藏結束時，乙烯利+1-MCP處理組和對照組ADH活力無顯著差異，且均顯著高于1-MCP處理組。

由圖5B、C可知，各組香蕉在貯藏過程中ADH基因表達量整體呈現先上升再下降的趨勢。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉ADH1表達量高峰的出現，并降低峰值大小，且乙烯利+1-MCP處理組ADH1表達量峰值高于1-MCP處理組。1-MCP處理對ADH2基因表達的抑制效果相對ADH1更明顯，乙烯利結合1-MCP處理能夠有效減弱1-MCP對香氣代謝中ADH基因表達的抑制作用。對于ADH2表達量，對照組、乙烯利+1-MCP處理組、1-MCP處理組高峰出現的時間分別為第10、10、12天，且乙烯利+1-MCP處理組和對照組組高峰值無顯著差異，但是1-MCP處理組高峰值明顯低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組高峰值，說明1-MCP抑制了ADH2基因的表達。

圖5 不同處理對香蕉貯藏期間ADH活力（A）和ADH1（B）、ADH2（C）基因表達量的影響Fig. 5 Effects of different treatments on the activity of ADH (A) and gene expression of ADH1 (B) and ADH2 (C)

2.2.3 AAT活力和基因表達的變化

AAT是香氣代謝中氨基酸代謝途徑的重要酶，也是該途徑中的末端酶，AAT的活力直接影響到酯類物質的含量。從圖6A可知，AAT活力的變化與ADH活力變化趨勢一致，對照組AAT活力在整個貯藏期間不斷上升，乙烯利+1-MCP處理中AAT活力在催熟前受到一定抑制，其活力低于對照組，但催熟后AAT活力迅速上升。1-MCP處理組AAT活力在整個貯藏期均顯著低于對照組和乙烯利+1-MCP處理組。貯藏末期，乙烯利+1-MCP處理組和對照組AAT活力接近，與1-MCP處理組差異顯著。

如圖6B所示，對照組AAT表達量同ADH表達量變化趨勢一致，都是呈現先上升然后下降的趨勢。乙烯利+1-MCP處理組中AAT在0～5 d幾乎不表達，在前10 d的表達都較低，而后逐步升高再逐步降低。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中AAT基因表達量高峰的出現，卻并未降低峰值的大小，乙烯利+1-MCP處理組較1-MCP處理組催熟后AAT基因表達量峰值出現得更早。

圖6 不同處理對香蕉AAT活力（A）和AAT基因表達量（B）的影響Fig. 6 Effects of different treatments on the activity (A) and gene expression (B) of AAT

2.2.4BCAT和PDC基因表達量

支鏈氨基酸轉氨酶（branched-chain amino acid transaminase，BCAT）在香蕉香氣氨基酸代謝途徑中是起始酶，使支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等進行轉氨基后轉換為對應的酮酸，為香氣代謝提供前體物質。從圖7A可知，各組果實BCAT表達量在前10 d較低，對照組在第12天急劇上升至高峰，而后逐步降低至平穩狀態；乙烯利+1-MCP處理組BCAT表達量在12 d后開始逐漸上升，至第18天到達高峰；1-MCP處理組在14 d后才開始逐漸上升，至第20天達到表達高峰。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中BCAT基因表達量高峰的出現，卻并未降低峰值的大小。相對單獨1-MCP處理，乙烯利+1-MCP處理誘導了香蕉果實在成熟期BACT表達。

丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）是香蕉香氣氨基酸代謝途徑中的中間酶。由圖7B可知，PDC表達量沒有典型的變化趨勢，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉PDC基因表達量高峰的出現，并降低峰值的大小，其中1-MCP處理抑制效果更加明顯。1-MCP會抑制香氣代謝中PDC基因的表達，從而抑制了香氣物質的生成，乙烯利結合1-MCP處理會一定程度減輕這種抑制作用。

圖7 不同處理對香蕉香氣代謝中BCAT（A）和PDC（B）基因表達量的影響Fig. 7 Effect of ethephon combined with 1-MCP on the expression of BCAT (A) and PDC (B) genes

2.2.5 香氣成分含量與香氣合成關鍵酶活力和基因表達量相關性分析

如表2所示，己醛含量與ADH1表達量呈極顯著相關；反-2-己烯醛含量與LOX活力顯著相關，與ADH1表達量呈顯著相關，乙醇含量與ADH活力呈顯著相關，與AAT活力呈極顯著相關；酯類含量與ADH活力、AAT活力都均呈極顯著相關；總揮發性物質含量與ADH活力、AAT活力也呈顯著或極顯著相關。各基因中，僅ADH1表達量表現出與揮發性物質中的醛類物質含量有極顯著相關性，其他基因的表達量與揮發性物質含量均未表現出顯著相關性，說明香氣代謝中的相關酶與香氣代謝的關系比基因表達與香氣代謝的關系更為密切。

表2 貯藏期間香蕉香氣物質含量與相關酶活力、基因表達量之間的相關性分析Table 2 Correlation analysis of volatile substances with enzyme activities and gene expression in banana fruits during ripening process

2.3 主成分分析

香蕉的香氣物質主要在果實成熟后期形成。為了研究不同處理對香氣物質的影響，對貯藏12 d后所有測定指標進行了主成分分析。如圖8所示，PC1和PC2可以解釋所有組分的68.8%，其中PC1占46.89%，PC2占21.91%。相對于對照，不同處理都對香蕉果實后期的香氣成分和酶活力以及基因表達量產生了顯著影響（圖8A）。盡管不同處理組沒有完全分開，但是不同處理組之間差異顯著（R2=0.22、P=0.005）。從圖8B中可以出，乙酸乙酯、丁酸異戊酯、丁酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙醇含量和ADH、AAT活力為主成分PC1的主要的貢獻者，這也和香蕉成熟過程中的特征香氣物質相符合。而己醛含量和AAT、ADH2、PDC、BACT基因表達量，以及反-2-己烯醛含量為主成分PC2的主要貢獻者。這解釋了這些香氣物質、酶活力以及基因表達對香蕉果實后期香氣物質的貢獻較大。而表3展示的是不同處理樣品對于主成分的貢獻值，與對照相比，1-MCP處理整體上對主成分PC1和PC2的影響更大，而乙烯利+1-MCP處理相對單獨1-MCP處理來說，對主成分PC1和PC2的整體影響較小。說明乙烯利+1-MCP處理能顯著減輕單獨1-MCP處理對果實香氣物質的影響。

圖8 不同處理條件下香蕉果實貯藏12 d后各指標之間主成分分析（A）及各指標在主成分PC1和PC2中的比重（B）Fig. 8 Principal components analysis (PCA) of aroma components,aroma synthesis-related enzyme activities and gene expression in banana fruits under different treatment conditions after 12 days of storage (A)and contribution of each component to PC1 and PC2 (B)

表3 不同樣品對主成分貢獻值Table 3 Contribution of first five PCs to total variance for different samples

3 討 論

3.1 乙烯利結合1-MCP處理對香蕉中香氣物質形成的影響

1-MCP對果實風味的影響主要是抑制其芳香物質的形成，果實的揮發性醇和酯總量減少[14]。香蕉果實主要在呼吸躍變高峰出現前后產生揮發性芳香物質，香蕉果實在成熟后期產生大量的酯類，這是果香型香氣的主要成分，酯類物質的產生需要乙烯的作用，而1-MCP處理明顯降低了組織對乙烯的敏感性。1-MCP處理導致果實呼吸速率下降和代謝活性的下降，可能導致香氣合成底物供給不足，從而改變揮發性物質形成的途徑，進而改變了芳香物質的量。不僅在香蕉上有這樣的結果，在蘋果、油桃、梨、獼猴桃、桃等水果中都有類似的現象[15-18]。在采收成熟度較高的粉蕉果實上，1-MCP處理濃度過高或時間過長，也會導致粉蕉果實果皮轉色和果肉軟化不一致[26]，這些都限制了1-MCP在香蕉貯藏保鮮中的應用。

乙烯利+1-MCP處理不但能顯著延緩香蕉衰老和延長保鮮期，解決1-MCP引起的果皮轉黃不均勻的后熟障礙問題，而且能極大改善香氣的種類、總量、酯類含量。乙烯利+1-MCP處理組香蕉果實對乙烯有正常的響應，揮發性物質含量相對于單獨1-MCP處理組上升更快[11]。在本實驗中進一步驗證了1-MCP結合乙烯利處理可以顯著減輕單獨1-MCP處理對香氣物質形成的影響。

香氣的產生與乙烯的作用密切相關。乙烯實際上是通過調節香蕉后熟進程而間接影響其揮發性物質的變化。相關研究發現，外源乙烯能增加蘋果特征香氣物質積累，而乙烯作用抑制劑1-MCP則起著相反的作用，顯著抑制了蘋果“果香型”香氣物質的含量，乙烯和1-MCP通過調控香氣合成相關基因的表達，調控香氣的合成[16]。蘋果低溫貯藏條件下乙烯釋放量和特征香氣物質含量呈顯著正相關性，因此乙烯釋放量可以作為評價蘋果香氣物質的潛在指標，達到無損簡易檢測的目的[27]。Shalit等比較了呼吸躍變型和非躍變型兩種甜瓜品種的香氣物質，發現躍變型果實能產生大量乙烯，有很濃的香氣；非躍變型果實釋放的乙烯較少，而香氣也較淡[28]。新近的研究報道，甜瓜中乙烯合成關鍵基因ACO1的RNA干擾顯著影響了果實成熟，主要通過影響相關基因的低甲基化，抑制了成熟相關基因的表達，進而影響氨基酸分解代謝的芳香族化合物的積累[29]。番茄果實中，果實成熟相關的自催化系統II乙烯對番茄成熟期特征香氣物質的形成起著至關重要的作用，決定了番茄紅熟期的風味[30]。最新的研究發現，乙烯可以通過調控轉錄因子NOR/NAC的甲基化修飾，調控酯類代謝關鍵基因AAT的甲基化修飾，調控其表達，進而調控不同果實包括番茄、桃和蘋果的酯類物質形成[31]。對于非呼吸躍變型果實的香氣物質形成，乙烯也起著重要的作用。Sdiri等分析了乙烯退綠對不同品種柑橘香氣的影響，發現一些柑橘品種的香氣也受到乙烯處理的影響[32]。本課題組前期研究也發現，香蕉果實成熟過程中乙烯的釋放量與乙醇、酯類物質和總揮發性物質的釋放量呈極顯著正相關[11]。

本實驗研究發現，1-MCP處理降低了香蕉揮發性物質的總量和酯類含量，在貯藏末期也未能改變這種現象，揮發性物質的總量和酯類含量仍然低于對照組。而用1-MCP結合乙烯的香蕉與1-MCP處理組相比，提高了揮發性物質的總量和酯類含量，有效地改善了1-MCP對香蕉香氣的抑制作用，這種作用在催熟后更為明顯，也表明了乙烯對香氣調控的重要作用。對于梨果實，長期低溫貯藏后，相對于單獨1-MCP處理來說，1-MCP結合乙烯處理也能顯著改善貨架期梨果實的香氣，有效保持果實的風味[33]。

3.2 乙烯利結合1-MCP處理對香蕉香氣脂肪酸代謝途徑相關酶活力和基因表達的影響

果實香氣成分中的直鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質主要來源于脂肪酸氧化。直鏈脂肪族醛類及其他香氣物質主要通過脂肪酸代謝途徑中的β-氧化和LOX氧化實現。LOX氧化產生的C6醛和C6醇等果實青香氣味[34-35]。脂肪酸作為酯類合成的前體之一，主要通過β-氧化和LOX氧化這兩種途徑生成。LOX催化植物中亞油酸、亞麻酸這兩種主要的多聚不飽和脂肪酸底物發生過氧化氫化反應，產生9-(S)-或13-(S)-氫過氧十八碳二烯酸或9-(S)-或13-(S)-氫過氧十八碳三烯酸，經過進一步代謝，如經氫過氧化物裂解酶催化轉化為醛類、醇類和揮發性酯類[36]，所以LOX在果實直鏈型揮發性物質的生成過程中起到了重要作用。

在本研究中，香蕉貯藏過程中LOX活力變化趨勢和己醛、反-2-己烯醛含量的趨勢完全相反，對照組、乙烯利+1-MCP處理組和1-MCP處理組的LOX基因表達量峰值出現的時間依次延后，說明乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中LOX基因的表達。相關性分析發現己醛含量與LOX活力、LOX基因表達量無顯著相關性，推測己醛的產生與LOX活力和LOX基因表達關系不大。有研究報道稱，果實芳香成分中直鏈脂肪族醇、醛、酮物質主要來源于脂肪酸代謝路徑。部分果實的芳香揮發物合成途徑中，脂肪酸是主要的前體物質，脂肪酸經過氧化作用成類脂，然后經LOX催化形成醛、酮、酸、醇、內酯和酯等芳香物質[37]。完整果實的芳香揮發物通過β-氧化途徑合成[37]，而當果實組織腐爛后則通過LOX途徑合成，因此推測香蕉綠硬時期的特征香氣物質中的直鏈脂肪族醛類并不是來源于LOX途徑，而主要是通過β-氧化路徑合成。

3.3 乙烯利結合1-MCP處理對香蕉香氣氨基酸代謝途徑相關酶活力和基因表達的影響

果實香氣成分中支鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質主要來源于氨基酸代謝。氨基酸通過轉氨作用形成支鏈酮酸，一條途徑是在脫羧酶作用下生成醛，然后在ADH的作用下生成醇；另一條途徑是與輔酶A（CoA）生成酰基CoA，然后在AAT作用下生成酯。支鏈氨基酸首先通過轉氨基作用生成支鏈α-酮酸，這個過程需要在BCAT催化作用下進行，再在PDC的作用下脫羧生成相應的醛類。

3.3.1 乙烯利結合1-MCP處理對ADH活力及基因表達的影響

脂肪酸和氨基酸代謝產生的醛在ADH的作用下形成醇類物質。蘋果中的ADH以NAD和NADH為輔因子，其ADH在體外pH值為5.5～6.0時將醛還原成醇，pH值為7.0～10.0時將醇氧化為醛[38]。因此，ADH可能與香蕉香氣中的醇類和醛類含量有著密切的聯系。Defilippi等發現1-MCP并不會影響ADH的活力，但會抑制AAT活力[39]。

本實驗結果表明，乙烯利+1-MCP處理會抑制ADH活力，但該抑制作用并不是不可逆的，在果實催熟后，該酶活力很快出現上升的趨勢，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中ADH1基因表達量高峰的出現，且降低了峰值的大小。乙烯利+1-MCP處理組ADH1基因表達量峰值較1-MCP處理組更大；1-MCP處理明顯抑制了ADH2基因的表達，使其整個貯藏過程表達量都很低，而乙烯利+1-MCP處理組ADH2表達量與對照組整體上差異不大；表明乙烯利結合1-MCP處理能夠有效降低或者消除1-MCP對香氣代謝中ADHs基因表達的抑制，以此達到增加香氣物質和改善果實品質的目的。ADHs基因表達量的高峰出現時間早于ADH活力高峰出現時間，乙醇含量和ADH活力變化趨勢一致，但ADH活力開始快速增加時間點早于乙醇，因此，當ADHs基因表達量達到高峰之后，ADH活力才快速上升，然后才產生大量的乙醇。推測香氣的形成與ADH活力和ADH基因表達具有顯著的相關性。

3.3.2 乙烯利結合1-MCP處理對AAT活力及基因表達的影響

酯類物質的合成由醇和酰基-CoA在AAT的作用下合成，這一過程為需氧過程[38]。AAT活力及其對底物的選擇性影響果實香氣成分中酯類的含量和種類。Pérez等對4個品種草莓果實成熟期間AAT活力的研究表明，各品種AAT活力均隨果實成熟而增加，但不同品種最大活力差異很大，活力越低風味也越差[22]。缺乏香氣的甜瓜品種‘Rochet’果實無AAT活力[28]。香蕉果實AAT最適底物為乙酰-CoA、丙酰-CoA和丁醇，而對丁酰-CoA活力很低[40]。醇的供應被認為是AAT催化酯類合成的限制因子，體外供應丁醇，蘋果果實的乙酸丁酯和丁酸酯類合成增加，體外供應乙醇和己醇則促進乙酯和己酯的合成[39]。因此，AAT可能與香蕉香氣中的酯類物質的合成密切相關。

本實驗結果表明，AAT活力在整個貯藏期間不斷上升，貯藏結束時，乙烯利+1-MCP處理組和對照組AAT活力接近，且顯著高于1-MCP處理組。這表明乙烯利+1-MCP處理對AAT活力的抑制作用不是不可逆的。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉AAT基因表達量高峰的出現，卻并未降低峰值的大小。結合揮發性物質的量分析，酯類含量和AAT活力變化趨勢一致，當AAT基因表達量達到高峰之后，才出現較高的AAT活力，繼而產生大量的酯類物質產生。因此酯類的含量與AAT活力具有極顯著的相關性，AAT在酯類的生成過程中發揮著至關重要的作用。

3.3.3 乙烯利結合1-MCP處理對氨基酸途徑中BCAT和PDC基因表達的影響

BCAT通過轉氨基作用將纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸轉化為酮酸，酮酸再在PDC的作用下脫羧生成相應的醛類[41]，這兩個酶是氨基酸代謝途徑的起始酶，因此BCAT和PDC基因表達也與香氣代謝密切相關。但是關于1-MCP對BCAT和PDC基因表達的影響較少報道。本實驗中，乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉中支鏈BCAT基因表達高峰的出現，卻并未降低峰值的大小。對照組PDC基因表達量呈現上升后下降再上升再下降的趨勢。乙烯利+1-MCP和1-MCP處理能夠延緩香蕉PDC基因表達量高峰的出現，降低了峰值的大小，但是1-MCP處理組PDC表達量高峰僅在貯藏后期才出現，而乙烯利+1-MCP處理和對照組PDC基因表達量峰值都出現在貯藏前期。說明1-MCP會影響了PDC基因表達，從而影響了香氣物質在貯藏期的生成，而乙烯利結合1-MCP處理能減輕了這種影響，在貯藏前期便出現表達高峰。

本實驗揭示了乙烯利+1-MCP處理對香蕉成熟過程中揮發性物質、香氣合成相關關鍵酶活力和相關基因的表達特性的影響以及它們之間的關系，為香蕉采后的1-MCP處理保鮮技術提供理論指導，也為1-MCP處理在香蕉產業上的商業應用提供技術支撐和理論參考。