基于噬菌體的電化學生物傳感器在檢測食源性病原菌中的研究進展

王 吉，李慧慧，朱文娟，王 佳，王小紅,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學理學院，湖北 武漢 430070）

在全世界范圍內(nèi)食源性疾病一直是嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。食源性疾病最常見的臨床癥狀表現(xiàn)為胃腸道疾病，其中腹瀉疾病最為嚴重。腹瀉通常是由于食用了被食源性病原菌（如沙門氏菌（Salmonella）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））等污染的食物引起的[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2015年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有5.5億 人患病和23萬 人死亡，且病例廣泛分布在世界各個國家，無論是發(fā)達國家還是中等和低收入國家都有一定數(shù)量的食源性疾病暴發(fā)[3]。到目前為止，食源性病原菌的快速檢測依舊是研究的熱點，除了傳統(tǒng)的微生物學培養(yǎng)方法和生理生化鑒定外，其他的檢測方法也不斷被開發(fā)，例如免疫學方法[4-5]（酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、免疫層析試紙法等）、分子生物學方法[6-7]（聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR技術(shù)、基因芯片等）、生物傳感器等，這些技術(shù)雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)方法耗時費力的問題，但依舊或多或少存在著一些不足之處。

生物傳感器是由生物感受器（識別元件）、換能器及信號放大裝置構(gòu)成的一種分析檢測工具[8]。根據(jù)識別元件的不同可以分為酶傳感器、抗體傳感器、細胞傳感器、DNA、適配體傳感器等；識別元件是生物傳感器的關(guān)鍵部件。根據(jù)換能器類型不同可分為熱學生物傳感器、光學生物傳感器、電化學生物傳感器等。電化學生物傳感器的基本原理是生物識別元件捕獲目標分析物后，在電極界面上進行電化學反應(yīng)從而引起傳感器表面的電流、電位、阻抗等電信號的變化，根據(jù)監(jiān)測到的電信號的變化來定量目標分析物的濃度[9]。近年來，伴隨著新型生物識別元件噬菌體的介入以及高靈敏度電化學分析儀等有效手段的開發(fā)，利用電化學生物傳感器檢測食源性病原菌技術(shù)得到了極大的發(fā)展[10-19]。與酶、抗體、核酸等識別元件相比，新型識別元件噬菌體由于其穩(wěn)定性高且對細菌的特異性強而越來越多地被應(yīng)用到電化學生物傳感器中[20-22]。

噬菌體是一種能夠特異性吸附感染細菌的病毒，廣泛存在于地球上，其種類繁多、數(shù)量龐大。噬菌體是專性活細胞內(nèi)寄生物，具有不同的生命周期，可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體兩類[23]。烈性噬菌體是其核酸侵入宿主細胞后短時間內(nèi)就引起宿主細胞裂解的一類噬菌體；溫和噬菌體是其核酸侵入宿主細胞后，核酸附著并整合在宿主染色體上，隨宿主細胞的核酸同步復(fù)制，短時間內(nèi)不引起宿主細胞裂解但抑制其生長的一類噬菌體[24]。基于這一特性，目前已經(jīng)有多種噬菌體被直接應(yīng)用到食源性病原菌的防控中[25-28]，如由美國Intralytix公司開發(fā)的ShigaShield噬菌體制劑被應(yīng)用于食源性/水源性志賀菌污染的控制[25]；由荷蘭Micreos公司研制的Salmonelex噬菌體雞尾酒制劑被應(yīng)用于肉類和禽類產(chǎn)品中沙門菌污染的控制等[26]。噬菌體除了被應(yīng)用到病原菌的防控上，也被用于病原菌的檢測中。噬菌體被用作電化學傳感器的識別元件主要是由于它具有以下的特性：第一，噬菌體粒子在納米范圍內(nèi)具有明確的幾何形狀和尺寸[29]，在適當?shù)木彌_液中它們被認為是單分散的納米粒子；第二，噬菌體表面有廣泛被修飾的可能性，噬菌體可以通過基因工程在其表面展示外源肽[30-31]，也可以通過化學修飾在其表面獲得新的官能團，這些修飾賦予噬菌體粒子新的特性，使其能與所需的目標分析物結(jié)合；第三，噬菌體在自然界種類多、數(shù)量大[32-33]，幾乎能設(shè)計出對每種細菌都有特異性的生物傳感器。基于這些特點，研究者對利用噬菌體修飾的電化學生物傳感器產(chǎn)生了濃厚的興趣。因此，本文著重綜述了噬菌體應(yīng)用于電化學生物傳感器中的兩個主要方面：1）噬菌體在電極表面的固定化方法；2）基于噬菌體作為識別元件的電化學傳感器檢測食源性病原菌的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。

1 噬菌體在電極表面的固定方法

基于噬菌體的電化學生物傳感器首先需要將噬菌體顆粒牢固地固定在傳感器表面上，這樣它們才能作為目標的識別元件而發(fā)揮作用。但這樣的傳感器用于檢測還需要滿足幾個條件，首先，固定的噬菌體必須保持其活性，即具有特異性識別細菌細胞的能力，盡管噬菌體比抗體更能抵抗惡劣的環(huán)境，但它們依然會由于環(huán)境干燥或生存條件的快速變化而失活；其次，噬菌體在傳感器表面的大量吸附和均勻分布是獲得高靈敏度生物傳感器的重要保障，同時也應(yīng)考慮噬菌體受體的可用性，特別是以形狀不規(guī)則有尾噬菌體作為識別元件情況下的可用性；最后，保證噬菌體不從電極表面解離到分析液中也是至關(guān)重要的。目前，已經(jīng)有文獻報道了如何將噬菌體固定在傳感器表面的方法，常用的固定化方法包括噬菌體粒子在基質(zhì)表面的物理吸附、共價結(jié)合、利用特定的相互作用（例如生物素-親和素、靜電相互作用）以及噬菌體粒子被截留到導(dǎo)電聚合物基質(zhì)中等。

1.1 物理吸附

隨機物理吸附是將生物分子固定在固體基質(zhì)上最簡單、最快捷的方法。因為物理吸附不需要對生物組分進行預(yù)活化、化學修飾或利用交聯(lián)劑，也不依賴多步驟和長時間的實驗過程。因此，在生物分子固定研究中經(jīng)常被使用。

Mejri等[34]采用了物理吸附法將噬菌體顆粒固定在金電極上。該研究首先制備了交叉指狀金電極，之后進行超聲清洗，以確保電極表面潔凈，隨后直接滴涂上T4噬菌體溶液，并在37 ℃潮濕的環(huán)境中孵育90 min，以防止噬菌體溶液蒸發(fā)。隨后用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）徹底洗滌，并用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液封阻，最后借助電化學阻抗生物傳感器檢測大腸桿菌。利用簡單的物理吸附固定噬菌體不僅可被應(yīng)用于電化學生物傳感器，在其他類型的生物傳感平臺中也可以被使用。例如，Olsen等[35]使用憑借噬菌體展示技術(shù)獲得的絲狀噬菌體顆粒作為識別元件，通過物理吸附將其固定在磁彈性傳感器表面。一些研究利用磁彈性傳感器進行檢測也獲得了成功[36-41]。此外，Balasubramanian等[42]利用能特異性裂解金黃色葡萄球菌ATCC 12600的噬菌體為識別元件，也通過物理吸附的方式將其固定在以表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）為檢測平臺的金傳感器表面。

用物理吸附法固定噬菌體快速簡便，避免了耗時復(fù)雜的化學改性過程。然而，由于液體的剪切力等因素，物理吸附的噬菌體往往會從載體表面脫落。因此，有必要對制作的傳感器在測定條件下的穩(wěn)定性進行驗證。在制作了基于噬菌體的電化學生物傳感器后，Mejri等[34]對電極的穩(wěn)定性進行了探究，結(jié)果表明，在T4噬菌體物理吸附至金表面的情況下，阻抗信號至少可以在5 h內(nèi)保持穩(wěn)定。然而，通過物理吸附固定的噬菌體在傳感器表面的定向是隨機的，這將導(dǎo)致許多已經(jīng)吸附上的噬菌體不能用于分析。Richter等[43]提出了噬菌體在電極表面的準確定向方法，其利用靜電場效應(yīng)，使噬菌體的頭部附著在金表面，尾纖蛋白被釋放，從而增加了金表面有效噬菌體的數(shù)量。這種處理被認為是可行的，因為有尾噬菌體的頭部包含帶負電荷的DNA，尾部有帶正電荷的尾纖蛋白[44]。與隨機吸附的噬菌體相比，固定同樣數(shù)量的噬菌體顆粒，在有電場的條件下，傳感器表面捕獲的細菌數(shù)量增加了4 倍。

1.2 共價鍵合

噬菌體與電極表面發(fā)生化學反應(yīng)，通過共價鍵而固定下來。該方法固定的噬菌體比物理吸附固定的噬菌體更加穩(wěn)定，在相同的環(huán)境下提供了更有力的結(jié)合，而且在測定過程中噬菌體從固定表面分離的機會也更少。因此，在電化學生物傳感器中更常用這種固定化方法[45]，并已開發(fā)出多種不同的化學鍵合方式。

Jia Yunfang等[46]創(chuàng)建了一種使用戊二醛作為連接劑將噬菌體共價固定在傳感器表面的方法。他們在電位傳感器的氮化硅層上附著一層(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysilane，APTES），以獲得氨基表面，然后加入戊二醛，在醛和伯胺之間形成共價鍵，M13噬菌體以同樣的方式與戊二醛的另一個醛基共價連接，從而形成穩(wěn)定的噬菌體層。Handa等[47]也利用醛和伯胺的反應(yīng)將噬菌體P22固定在(3-氨基丙基)三甲基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，APTMS）修飾的玻璃襯底上。Shabani等[48]也使用了類似的方法，首先在碳電極表面通過電化學還原4-硝基苯重氮離子而生成氨基團，然后用戊二醛處理電極，并浸入噬菌體γ溶液中。此外，Tlili等[49]提出了另一種胺-胺偶聯(lián)技術(shù)，在金電極上覆蓋半胱胺，以1,4-二硫氰酸酯作為交聯(lián)劑，然后固定T4噬菌體。Sedki等[16]采用了另一種化學鍵合的方法固定噬菌體，在該研究中，玻碳電極表面通過電化學沉積上金納米粒子，然后浸入3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）溶液中，通過巰基-金的自組裝作用，在金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）表面修飾上羧基，之后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC）和N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽（N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHS）活化羧基，M13噬菌體通過表面的氨基與活化羧基之間形成酰胺鍵而被固定下來（圖1）。這種固定方法已經(jīng)被廣泛的使用，在Han Lei[50]、Narayanan[51]等的研究中也采用了類似的固定方法。

圖1 噬菌體共價固定在金電極表面示意圖[16]Fig. 1 Schematic diagram of phage covalently immobilized on the surface of gold electrode[16]

盡管通過共價鍵合的方法固定噬菌體大多數(shù)需要昂貴試劑和多步驟處理，但因為它們能夠提供穩(wěn)定和致密的噬菌體層，所以這種方法也經(jīng)常得到使用。Singh等[52]比較了物理吸附法以及糖類、半胱氨酸和半胱胺修飾的金表面固定噬菌體的數(shù)量，且半胱氨酸、半胱胺組同時用體積分數(shù)2%戊二醛處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用相同濃度的噬菌體去吸附，半胱胺+戊二醛修飾組固定的噬菌體量最多，比單純物理吸附高37 倍，隨后將經(jīng)噬菌體修飾的金表面暴露于宿主大腸桿菌EC12中，通過熒光顯微鏡確認捕獲大腸桿菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)該方法捕獲的菌量為（11.9±0.2）個/100 μm2，是物理吸附法捕獲菌量的9 倍。

1.3 特定的相互作用

隨著基因工程和分子生物學技術(shù)的日漸成熟，利用噬菌體展示技術(shù)獲得的新型噬菌體也被廣泛應(yīng)用到電化學生物傳感器中。生物素-親和素是目前已知的強度最大的非共價作用復(fù)合物，其親和常數(shù)可達到10～15 mol/L[53]，因此在噬菌體的固定化中也可利用生物素-親和素之間的這種天然親和力。在Gervais等[54]的研究中，其首先通過噬菌體展示技術(shù)獲得修飾了生物素的T4噬菌體；然后將金電極浸入含有磺化氨磺酸鏈霉親和素的溶液中以獲得覆蓋層；再將金電極和噬菌體懸液混合，噬菌體則通過生物素/鏈霉親和素之間的親和力被修飾到傳感器表面。這種方法固定的噬菌體密度為4.4個/μm2，與物理吸附相比增加了15 倍。

另一種相互作用是靜電吸引，噬菌體利用自身所帶電荷與固體基質(zhì)表面之間的靜電力相互作用而固定下來。據(jù)報道，大多數(shù)病毒的凈電荷為負[55-56]。Anany等[44]進一步研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌體的頭部Zeta電位為負，而尾部纖維電位為正，這意味著噬菌體可以被靜電吸引到帶電的固體基質(zhì)表面。因此，Cademartiri等[57]基于靜電相互作用將4種形態(tài)不同的噬菌體固定在改性的二氧化硅表面上，該研究用3種不同的試劑對二氧化硅表面進行了改性，將其表面電荷從帶負電荷調(diào)正為帶正電荷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離子表面的存在增加了與二氧化硅顆粒結(jié)合的活性噬菌體數(shù)量，且陽離子表面有利于噬菌體的正確定向，即“頭向下”和“尾巴向上”。在此基礎(chǔ)上，Anany等[44]成功地將噬菌體固定在帶正電荷的纖維素膜上，而且還發(fā)現(xiàn)固定在帶正電荷膜上的噬菌體數(shù)量明顯高于未改性膜上的噬菌體數(shù)量。Zhou Yan等[13]也采用靜電相互作用將T2噬菌體固定在玻璃化的聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）修飾的碳納米管上。他們用相對于Ag/AgCl電極+0.5 V的電位施加在工作電極上，通過噬菌體與碳納米管的靜電吸引作用，實現(xiàn)了噬菌體顆粒在碳納米管上的定向固定（圖2）。

圖2 噬菌體在玻璃化的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管上定向和固定化的示意圖[13]Fig. 2 Schematic description of the charge-directed orientation and immobilization of bacteriophage onto polyethyleneimine-functionalized carbon nanotube (CNT) on electrode surface[13]

1.4 聚合物基質(zhì)的截留

另一種固定噬菌體的方法是在電極表面形成一種噬菌體聚合物膜。例如Ionescu等[58]首先提出了將噬菌體和導(dǎo)電聚合物混合的方法。其用吡咯-烷基銨單體和能與西尼羅河病毒免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G結(jié)合的T7噬菌體混合溶液修飾工作電極，然后控制電位進行電聚合，用該方法得到的噬菌體聚合物修飾電極可成功用于西尼羅河病毒IgG的檢測。隨后，其他研究人員也開展了一系列在導(dǎo)電聚合物基質(zhì)中截留噬菌體的研究，總體思路是采用電聚合法制備摻有噬菌體的導(dǎo)電薄膜，例如將電極浸入含有支撐單體、噬菌體顆粒和高氯酸鋰的溶液中，在電聚合過程中在電極表面上沉積一層薄膜[59-62]。經(jīng)噬菌體-單體復(fù)合薄膜修飾的電極已經(jīng)成功用于檢測M13噬菌體特異性抗體[49]和前列腺特異性膜抗原[59]。Farooq等[10]在此基礎(chǔ)上進行改進，將噬菌體截留在表面經(jīng)修飾的細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）基質(zhì)中，研制了一種新型的電化學生物傳感器。首先將羧化多壁碳納米管（carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs）添加到細菌纖維素基體中以獲得固體支持物（BC/c-MWCNTs），然后用聚乙烯亞胺對BC/c-MWCNTs進行表面修飾，使其表面帶正電荷，隨后將該復(fù)合物與噬菌體懸液混合6 h，噬菌體即被截留到復(fù)合材料中，并通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析證實了BC/c-MWCNTs-PEI-Phages生物界面的形成，隨后用該混合物作為電極，成功地檢出大腸桿菌（圖3）。

圖3 噬菌體被截留于碳納米管修飾的細胞纖維素中[10]Fig. 3 Phage entrapped in CNT-modified cellulose[10]

2 基于噬菌體的電化學生物傳感器在檢測致病菌中的應(yīng)用

自Clark等[63]制備了世界上第一個公認的生物傳感器后，生物傳感器便開始進入研究者的視野。為了改善生物傳感器的性能，一些元件被整合到其中。例如在識別元件中有酶、抗體、核酸[64]以及野生型或基因工程噬菌體[65-66]的加入。噬菌體與宿主細胞具有天然的親和性，因此可用于細菌的捕獲和檢測。此外，基因工程改造的噬菌體和噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用使噬菌體成為檢測各種目標物更加理想的探針。另一方面，生物傳感器的創(chuàng)新在于傳感平臺的不同，基于轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的不同可將生物傳感器分為光學（包括光吸收/反射、熒光、發(fā)光和光纖）[67-69]、質(zhì)量或質(zhì)量敏感型（如石英晶體微量天平、磁彈性和懸臂）[70-72]以及電化學（包括測量電流、阻抗、電容和電導(dǎo)）等傳感器。而近年來，電化學生物傳感器的發(fā)展更加迅速，特別是利用電化學生物傳感器檢測食源性病原菌。電化學生物傳感器被認為是最有效的檢測食源性病原菌的方法之一，主要是因為其固有的優(yōu)勢（如堅固性、易于小型化、出色的檢測限、低成本以及現(xiàn)場測試的可能性等）。在電化學生物傳感器中，目標分析物與傳感器的結(jié)合將導(dǎo)致電極界面電化學特性的變化，并產(chǎn)生可測量的信號，如電阻、電流、電勢等。

2.1 基于噬菌體的阻抗傳感器

目前大多數(shù)基于噬菌體的電化學傳感器都使用電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）作為檢測技術(shù)。EIS可測定由于固定在工作電極表面上的噬菌體因捕獲或裂解靶細菌細胞而引起的阻抗變化。

Tlili等[49]提出了一種無標記的阻抗型生物傳感器。其將半胱胺修飾在金表面上從而共價固定T4噬菌體，用EIS檢測E. coliB，利用[Fe(CN)6]3－/[Fe(CN)6]4－作為氧化還原探針，對不同濃度的細菌（103～109CFU/mL）進行了阻抗測定。隨著檢測細菌濃度的增加，可以觀察到電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct）明顯增加，這可以歸因于細菌細胞與固定的T4噬菌體結(jié)合而導(dǎo)致電極表面氧化還原反應(yīng)位點的封閉。該方法可在15 min內(nèi)完成檢測，檢出限為8×102CFU/mL。細菌濃度變化引起阻抗增加的趨勢也可以在其他研究工作中發(fā)現(xiàn)[16,73]。Moghtader等[73]開發(fā)了一種一次性鉛筆狀石墨電極（pencil graphite electrodes，PGE），該電極表面涂有金納米棒（gold nanorods，GNRs），以增加界面電導(dǎo)率，從而提高檢測靈敏度。該研究將對大腸桿菌K12具有特異性的T4噬菌體固定在修飾有金納米棒的石墨電極上，采用[Fe(CN)6]3－/[Fe(CN)6]4－氧化還原探針測定電極表面的電阻，結(jié)果表明，阻抗會隨著細菌濃度的增加而增加，在100 μL目標懸浮液中的檢出限為102CFU/mL。Bhardwaj等[74]也開發(fā)了一種絲網(wǎng)印刷石墨烯電極來特異性檢測致病菌Staphylococcus arlettae。其將能識別Staphylococcus arlettae的噬菌體通過化學鍵合法固定在石墨烯電極上，以含有5 mmol/L K3Fe(CN)6+K4Fe(CN)6·3H2O的PBS作為氧化還原探針測定電極表面電阻，結(jié)果顯示，在菌濃度為2.0～2.0×106CFU/mL范圍內(nèi)線性趨勢良好。Sedki等[16]也利用EIS檢測大腸菌群，其將金納米粒子沉積在玻碳電極表面，使用化學固定法將M13噬菌體粒子固定在上面。該生物傳感器的檢測限為14 CFU/mL，是迄今為止已經(jīng)報道的基于噬菌體EIS中檢測限最低的。EIS作為一種快速有效的監(jiān)測電極界面微小變化工具，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。

但是，一些研究人員在進行阻抗測定時發(fā)現(xiàn)，Rct與細菌濃度之間呈負相關(guān)[11,35,75]。Zhou Yan等[13]開發(fā)了一種基于T2噬菌體的碳納米管傳感器用于E. coliB的檢測。該學者發(fā)現(xiàn)當細菌濃度增加時，Rct反而降低，這與之前的研究結(jié)果[16,49,73]相反。為了揭示這個現(xiàn)象，該學者借助細菌生存力試劑盒研究了噬菌體和細菌之間的相互作用，將噬菌體與宿主菌混合，大約20 min后，用熒光顯微鏡觀察到活細菌細胞數(shù)量明顯減少，表明此時E. coliB細胞已被T2噬菌體感染并溶解。因此，Rct的降低可能是噬菌體感染引起細胞裂解的結(jié)果，由于細胞的裂解，細胞內(nèi)組分釋放，這些組分通常是高度可移動的離子材料（例如K+和Na+），從而增加了電極表面附近介質(zhì)的電導(dǎo)率，造成了電極阻抗的降低[34,59]。Mejri等[34]分別用附著有T4噬菌體和抗體涂層的指狀微電極檢測大腸E. coliK12，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與抗體涂層傳感器相比，用噬菌體檢測可以產(chǎn)生雙重信號，這反映了捕獲和裂解靶細菌細胞兩個過程。除了對細菌濃度進行定量分析外，他們還對傳感器的特異性進行研究，分別記錄了在存在E.coliK12和乳酸桿菌的情況下隨時間的延長阻抗的變化情況。結(jié)果表明，對于T4噬菌體的宿主細菌E. coliK12，檢測到阻抗首先由于細菌細胞附著而增加，然后由于細菌細胞的裂解而降低，而乳酸桿菌沒有明顯的阻抗變化。雙重信號的產(chǎn)生也有助于區(qū)分目標分析物與傳感器表面的非特異性吸附或交叉結(jié)合。Shabani等[75]也提出了由細菌和噬菌體相互作用而所引起類似的時間依賴性阻抗響應(yīng)。他們制備了一種T4噬菌體共價固定的絲網(wǎng)印刷碳電極（screen-printed carbon electrode，SPE）用于E. coliK12的檢測，并使用EIS對50 μL樣品進行阻抗檢測，確定檢測限為104CFU/mL。此后，Shabani等[48,76]還用噬菌體包被的磁珠濃縮樣品中的靶細菌細胞來進一步提高其傳感器的檢測性能，將這些改性磁珠與細菌懸浮液混合，依靠噬菌體特異性捕獲目標細菌，在測定過程中，添加磁場以將磁珠捕獲的細菌細胞吸引到傳感器表面。該研究通過磁分離步驟成功地將傳感器靈敏度提高了一個數(shù)量級，對E. coliK12和炭疽芽孢桿菌的檢出限都達到了103CFU/mL。

2.2 基于噬菌體的安培傳感器

除了廣泛使用的阻抗型檢測技術(shù)外，基于噬菌體的安培檢測技術(shù)也得到了研究。常用的檢測技術(shù)有差分脈沖伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法、循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法等。在該檢測技術(shù)中噬菌體多數(shù)情況下不被用作生物探針，而是用來感染并裂解溶液中的細菌，然后通過測定細胞裂解所釋放內(nèi)容物（酶等）的量來確定待檢菌的數(shù)量。

DPV法通過優(yōu)化充電電流來提高靈敏度、檢測限和擴大線性范圍。Wang Danhui等[15]開發(fā)了一種使用T7噬菌體檢測大腸桿菌的方法。他們用編碼β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，β-gal）的lacZ操縱子改造T7噬菌體，使其能夠在感染和裂解大腸桿菌細胞的過程中觸發(fā)β-gal的過表達并釋放大量的酶生物標志物。隨后以4-氨基苯基-β-吡喃半乳糖苷（4-aminophenyl-β-galactopyranoside，PAPG）為底物間接檢測噬菌體誘導(dǎo)β-gal的量。通過安培檢測技術(shù)監(jiān)測與細菌濃度成正比的對氨基苯酚（p-aminophenol，PAP）產(chǎn)物的量。Wang Danhui等[15]在多種液體樣品中進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測限會隨著時間的延長而提高，3 h檢測限可達105CFU/mL，7 h檢測限可達102CFU/mL。Neufeld等[11]也提出了一種利用噬菌體感染和安培檢測技術(shù)來檢測大腸桿菌的方法。該研究中使用攜帶編碼堿性磷酸酶報告基因的絲狀噬菌體M13K07，在噬菌體感染增殖過程中報告基因被表達，報告酶被引導(dǎo)至外質(zhì)膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。由于細胞壁的多孔結(jié)構(gòu)，底物對氨基苯基磷酸酯也可以順利地進入周質(zhì)空間，在酶的作用下生成對氨基苯酚產(chǎn)物，隨即發(fā)生擴散并能夠通過安培法進行測定，在3 h內(nèi)檢測限可達1 CFU/mL。此外，Yemini等[77]開發(fā)了一種基于噬菌體的絲網(wǎng)印刷電極檢測B. anthracis和M. tuberculosis的方法，該學者用Bacillus cereus和Mycobacterium smegmatis作為B. anthracis和M. tuberculosis的模型進行研究。由于電極上固定的噬菌體捕獲并裂解宿主菌，釋放α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶，造成反應(yīng)底物對氨基-苯基-α-D-葡糖吡喃糖苷（p-amino-phenyl-α-D-glucopyr-anoside，p-AP-α-GLU）和對氨基-苯基-β-二谷醇素（para-aminophenyl-β-D-glucopyranoside，p-AP-β-Glu）水解為PAP，對氨基苯酚在電極上被氧化從而引起電流的變化，該方法在8 h內(nèi)檢測限可達10 CFU/mL。

2.3 基于噬菌體的電容傳感器

在電化學生物傳感器中，當識別元件與目標分析物結(jié)合時，也會引起生物傳感系統(tǒng)中電容的變化。電容檢測的原理是基于金屬電極表面的雙電層，工作電極僅固定生物傳感元件時，會具有穩(wěn)定的雙電層電容響應(yīng)，而當目標分析物與電極表面上的生物傳感元件結(jié)合時會導(dǎo)致電容減小[78]。Niyomdecha等[79]開發(fā)了一種電容式流動注射系統(tǒng)來檢測沙門氏菌，其使用化學固定法將M13噬菌體修飾在聚酪胺/金電極表面上，首先將緩沖液以一定的流速注入流動注射系統(tǒng)以獲得電極表面電容基線，然后在緩沖液中加入一定量沙門氏菌，以相同的條件注入檢測系統(tǒng)中，這時電極上的噬菌體會和細菌之間產(chǎn)生結(jié)合，導(dǎo)致電極的電容發(fā)生改變，從而確定結(jié)合的沙門氏菌的量。該傳感器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，在實驗條件下能重復(fù)使用40多次，且在樣品流速為75 μL/min時，其檢測范圍為2.0×102～1.0×107CFU/mL。這種生物傳感器可以在動態(tài)體系中進行，有利于生物識別元件與目標分析物的結(jié)合，為利用噬菌體檢測病原菌提供了新的思路。

3 結(jié) 語

基于噬菌體的電化學生物傳感器因其高度的特異性、穩(wěn)定性和簡便等特點而受到極大的關(guān)注，同時，噬菌體展示技術(shù)的成熟也擴展了野生型噬菌體的應(yīng)用范圍，研究者可以利用噬菌體展示技術(shù)在噬菌體表面獲得不同的肽或蛋白質(zhì)，從而提供與更多目標分析物結(jié)合的可能性。近年來，已經(jīng)研發(fā)出多種不同的固定方法將噬菌體修飾到傳感器的表面，包括物理吸附、化學修飾、特定的相互作用和物理截留等。同時基于噬菌體天然偶極子性質(zhì)的電沉積也愈發(fā)引起研究者的關(guān)注，因為它可以誘導(dǎo)噬菌體的準確定向，與隨機吸附相比，在電荷輔助的條件下增加了有效噬菌體的固定數(shù)量。噬菌體作為電化學生物傳感器的識別元件，在原料的獲得上更加簡便，噬菌體在自然環(huán)境中大量存在，與酶、抗體、核酸等相比，只需要通過簡單的篩選步驟即可獲得對某一細菌具有特異性的噬菌體；其次，噬菌體的耐受能力強，其對溫度、pH值、有機試劑以及其他不良環(huán)境都有一定的耐受力。在研究過程中，將特異性強的噬菌體與簡便快捷的電化學傳感技術(shù)結(jié)合起來，制得的電化學生物傳感器更加靈敏、準確，同時也極大提高了檢測的效率。

盡管過去幾年中基于噬菌體電化學傳感器的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但在實際應(yīng)用中仍然面臨許多挑戰(zhàn)。噬菌體作為活體生物材料用作識別元件時，一方面會由于環(huán)境干燥而失活，從而喪失與目標分析物結(jié)合的能力；另一方面，目前用于研究的噬菌體大多是溫和的絲狀噬菌體，而它們并不能夠?qū)λ械募毦加形侥芰Γ渌愋偷氖删w雖然也有使用，但它們普遍具有裂解性，在研究中會造成雙重信號的出現(xiàn)，影響檢測結(jié)果的準確性。同時實際樣品中也存在許多基質(zhì)，會影響檢測的靈敏度，制備的傳感器在環(huán)境和食品樣品檢測中的可重復(fù)性和穩(wěn)定性也仍需進一步驗證。因此，基于噬菌體的電化學生物傳感器在實際應(yīng)用中還需要進一步的創(chuàng)新與發(fā)展。

隨著對噬菌體研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)噬菌體編碼的蛋白（例如噬菌體編碼的受體結(jié)合蛋白（receptor binding proteins，RBPs））往往比噬菌體顆粒更適合作為識別元件用于生物傳感器中。RBPs是一類能將噬菌體結(jié)合到宿主細胞表面上的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白的統(tǒng)稱，包括尾纖蛋白、尾刺蛋白等。噬菌體之所以能夠特異性地識別并感染細菌，其主要原因是這些RBPs能與宿主菌表面特異性位點作用。相較于抗體而言，RBPs具有更高的穩(wěn)定性和特異性，例如對大多數(shù)抗體都無法有效識別的碳水化合物位點也具有一定的親和力；相較于噬菌體顆粒而言，RBPs不具備裂解細菌的能力，因而制備的生物傳感器更加持久穩(wěn)定。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，可以通過基因工程技術(shù)將不同受體蛋白結(jié)合域融合到噬菌體的RBPs上，從而擴大噬菌體的宿主范圍，這些研究都將為基于噬菌體的電化學生物傳感器的進一步發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。