茯苓功效成分茯苓酸的研究進展

徐德宏，譚朝陽，鄭 慧，張芳銘，侯鳳飛，戴鑫汶，李 玲，楊 勇,3,*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南補天藥業股份有限公司，湖南 懷化 418100；3.湖南省茯苓工程技術研究中心，湖南 懷化 418100；4.湖南中醫藥大學人文與管理學院，湖南 長沙 410208）

茯苓又稱玉靈、松柏芋、茯菟等，主要產于云南、湖南、湖北、安徽、貴州等地，是多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其大小不一、形塊無定，表皮深褐色或淺褐色，內質白色或稍帶粉紅色，中醫認為茯苓味甘、淡、平，歸心、脾、腎經，具有利水滲濕、健脾寧心之功效，臨床主要用于治療水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥狀[1]，《神農本草經》將茯苓列為“安魂養神，不饑延年”之上品，中醫有“十方九苓”之說法，故茯苓作為食藥同源功能性原料在保健食品領域有著十分廣泛的應用[2]。茯苓的保健功能涉及抗腫瘤、降血糖、改善睡眠和增強免疫力等方面，是具有重要開發價值的保健食品資源。

茯苓含多糖、三萜、甾醇、揮發油、蛋白質、氨基酸、核苷酸及微量元素等多種化學成分[3]，其三萜類物質因種類多樣且活性顯著而廣受關注。目前從茯苓中發現和鑒定的三萜類成分按照碳骨架結構主要分為羊毛甾-8-烯型、羊毛甾-7,9(11)-二烯型、3,4-開環-羊毛甾-8-烯型和3,4-開環-羊毛甾-7,9(11)-二烯型4種類型[4]。研究顯示茯苓三萜具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、美白及免疫調節等多種藥理作用[5]。茯苓酸（pachymic acid，PA）為羊毛甾-8-烯型三萜（圖1），分子式C33H52O5，相對分子質量528.763，單一純品為白色粉末，是茯苓的重要三萜成分之一，也是茯苓中除多糖外廣受關注的茯苓功效成分。本文對PA提取檢測、藥理活性、生物合成和茯苓的健康應用等方面進行系統論述，擬為PA在中醫藥健康食品領域的基礎研究和應用開發提供參考。

圖1 PA的分子結構Fig. 1 Molecular structure of pachymic acid

1 茯苓酸的提取與檢測

作為最受關注的茯苓三萜類成分，PA在茯苓中的總體含量并不高，因此如何高效提取是深入研究與應用的前提和基礎。馬巾媛等[6]對PA提取溶劑進行了對比研究，結果顯示5種提取溶劑（甲醇、無水乙醇、乙醚、氯仿和丙酮）中甲醇提取PA得率最高，若輔助超聲可進一步增加提取產量。蘭新財等[7]在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法對PA的乙醇提取工藝參數進行了考察，得到最佳工藝參數為：乙醇體積分數85%、料液比1∶6、提取溫度55 ℃、提取時間1 h。

高效液相色譜法是目前PA含量測定的主要方法，目前常采用的分析條件一般為：C18色譜柱，檢測波長為210 nm，乙腈-磷酸溶液或甲醇-磷酸溶液為流動相梯度洗脫，流速和柱溫分別為1 mL/min和30 ℃[8-10]。該方法操作簡便、專屬性好且穩定可靠，可作為茯苓原料中PA含量的分析方法[10]。

茯苓產地和產品等級對其PA含量有重要影響（表1），野生茯苓一般比栽培茯苓中PA含量高，高海拔略寒冷地區比沿海、平原及熱帶地區所產茯苓品質要優，所含PA含量也更高[11-15]。研究結果體現了“順境出產量，逆境促品質”的中藥材栽培品質規律，故在實際種植和使用茯苓時，需重視茯苓藥材的道地性，以及氣溫、濕度等生態環境對茯苓規范化種植的影響。段啟等對茯苓與茯苓皮PA含量進行了測定，結果顯示茯苓皮PA含量遠高于茯苓[16]，相關研究結果也支持了這一研究結論[17-19]。李蒙等對茯苓、茯神、茯神木及松根PA含量進行比較，結果顯示茯神木PA含量最高，茯神次之，茯苓最少，而松根未有PA的檢出[20]。宋瀟比較了茯苓皮、茯神、赤茯苓和白茯苓的PA含量，結果表明PA含量為茯苓皮＞茯神＞赤茯苓＞白茯苓[21]，該結果顯示茯苓顏色越深的部位一般PA含量越高，因而市場價格較低的茯苓皮因其PA含量相對較高，在實際生產中可作為提取PA的主要原材料。

表1 不同產地和等級茯苓中PA質量分數比較Table 1 Comparison of pachymic acid contents in P. cocos from different habitats and grades

2 茯苓酸的藥理活性

PA是茯苓三萜類成分的重要代表，現代藥理研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、鎮靜催眠等多種藥理活性[22]，下面擬對其相關研究進行分類總結和分析。

2.1 抗腫瘤作用

抗腫瘤活性在PA全部藥理活性中報道最多，其抗瘤機制主要有兩種：一是通過多種機制促進腫瘤細胞凋亡，從而實現直接抑瘤效果；二是通過促進腫瘤細胞對放療和化療的敏感性，從而實現間接抑瘤效果（表2）。癌癥是當今影響人類生命健康的一種重大疾病，PA具有的抗腫瘤功效使茯苓成為中醫藥健康食品開發利用的重要資源，可用于預防和輔助治療癌癥，同時也為研發和生產茯苓相關功能產品帶來了強盛的市場需求和可觀的經濟價值。

表2 PA抗腫瘤機制Table 2 Anti-tumor mechanism of pachymic acid

2.2 抗炎和抗氧化作用

炎癥或氧化應激與人體較多的慢性病和亞健康病理機制相關。由于茯苓在慢性病康復和亞健康干預方面具有較好療效，故其在保健領域中應用廣泛。茯苓具有良好的抗氧化和抗炎作用[3]，其三萜成分PA在該方面的作用機制也備受關注，相關研究結果[47-60]顯示PA可通過抑制促炎因子分泌、調節炎性蛋白和酶類活性、調控相關信號通路，實現抗炎和抗氧化作用（表3）。

表3 PA抗炎和抗氧化作用機制Table 3 Anti-inflammatory and antioxidant mechanisms of pachymic acid

2.3 降血糖作用

Huang Yuchuan等[61]通過實驗證實，PA在6種茯苓三萜中具有最強的促葡萄糖吸收活力。進一步機制研究發現，PA可提高葡萄糖轉運體（glucose transporters，GLUT）4在3T3-L1脂肪細胞中的表達量，刺激GLUT4從細胞內小泡向質膜的再分布，同時增加胰島素受體底物-1、Akt和AMP激活激酶（AMP-activated kinase，AMPK）的磷酸化，從而增強3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖攝取能力。此外，PA在分化的脂肪細胞中可誘導甘油三酯積累并抑制其分解。另一項對茯苓三萜降血糖的研究顯示，PA可顯著降低db/db小鼠的血糖水平，而且對鏈脲佐菌素處理的小鼠可增強其胰島素敏感性[62]。PA的降血糖作用為茯苓的降血糖保健作用提供了科學支持，也為茯苓作為降血糖健康食品的應用與開發提供了可靠依據。

2.4 鎮靜催眠作用

《神農本草經》中記載茯苓具有“安魂養神”之功效，其三萜成分PA對此可能發揮作用。Shah等[63]研究發現，口服PA能顯著抑制小鼠的運動活力，且與其他鎮靜催眠藥物合用時具有協同效應，例如與麝香醇合用時可縮短入睡時間，與戊巴比妥合用時則延長睡眠時間。進一步機制研究顯示，PA可增加γ-氨基丁酸受體的α和β-亞基水平，但降低γ-亞基水平，故PA通過γ-氨基丁酸能系統延長戊巴比妥鈉誘導下嚙齒動物的睡眠行為[63]。睡眠障礙已成為當今社會一種常見的“流行性疾病”，化學藥物治療睡眠毒副作用明顯，而以天然藥物成分或中藥為原料開發改善睡眠的保健食品或藥品具有更高的安全性。PA改善睡眠作用的實驗研究結果從物質基礎層面驗證了茯苓的中醫安神功能，可作為改善睡眠功能因子應用于保健食品。

2.5 抑制臟器移植排斥反應

Zhang Fan等對大鼠心臟移植后，PA保護外周血淋巴細胞免于凋亡的效應進行了研究，結果顯示PA可通過穩定外周血淋巴細胞線粒體跨膜電位來抗凋亡，其作用具有專一性，即穩定外周血CD8+淋巴細胞數量百分比，避免其異常增高，而對外周血CD4+淋巴細胞既不影響其凋亡，也不調節其細胞數量百分比[64]。在此基礎上，李春雨等對PA抑制心臟移植急性期排斥反應進行了研究，結果顯示PA低劑量組、PA高劑量組和環孢菌素A組心肌病理損害較對照組明顯減輕[65]。綜合以上結果，可以證明PA對心臟移植急性期排斥反應具有較好的抑制作用，有望將其開發成一種抗臟器移植排斥作用的新型免疫調節藥物。

2.6 改善多囊卵巢綜合征作用

PA具有抗炎、抗氧化和降血糖等多方面的藥理作用，而多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的發生受炎性細胞因子、活性氧和高胰島素血癥影響，因此現代研究表明，PA與PCOS的治療有關。Fu Xianpei等[66]對其治療PCOS的作用進行了研究，結果顯示PA與陽性藥物二甲雙胍具有相似的藥理作用，且在改善脂肪組織炎癥和線粒體異常方面優于二甲雙胍，以上這些發現提示PA能改善PCOS小鼠的內分泌環境和卵母細胞質量，因而PA是具有潛在PCOS治療作用的藥物分子。

2.7 其他藥理作用

周宏超等[67]對PA治療仔豬水腫病的機制進行了探索，結果顯示PA可通過抑制SLT-IIe誘導腸黏膜微血管內皮細胞分泌的細胞因子，緩解腸道微循環障礙，阻止微血栓形成，實現治療水腫病之目的。袁園等[68]在血管緊張素（angiotensin，Ang）II誘導下，探討了PA對H9c2細胞肥大和凋亡的影響及其機制，結果發現，5 μmol/L的PA能顯著影響1 μmol/L AngII處理24 h后的H9c2細胞，可顯著下降其細胞表面積和凋亡比例。進一步機制研究揭示PA顯著下降JNK的磷酸化水平，但不影響細胞非信號調節激酶和p38的磷酸化，故推測PA通過抑制JNK減輕AngII誘導的H9c2細胞肥大和凋亡。王偉等[69]發現PA對改善C57小鼠梗阻性腎積水間質纖維化具有較好效果，其機制主要是下調轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、磷酸化Smad蛋白（phospho-Smad protein，pSmad）2/3、MMP-9的表達來實現。此外，PA還具有調控5羥色胺3A受體活性[70]、抑制脂多糖誘導的NO生成[71]、抗枯草芽孢桿菌[72]等其他一些藥理活性。

3 茯苓酸的生物合成

PA具有多種重要藥理保健活性，預示其在醫藥與食品領域的應用價值較高。傳統提取PA的方法由于受到茯苓資源和品質的限制很難滿足市場需求，而PA作為三萜類化合物，其分子結構相對復雜，一般通過化學合成獲得PA的想法較難實現。當前，生物合成PA已取得一系列進展，有可能成為PA有效單體高效獲取的新途徑。

崔培梧等[73]對茯苓菌液態深層發酵進行了研究，并探討了4種氧載體（正己烷、正十二烷、吐溫-80、Triton X-100）對發酵后菌體生長、茯苓多糖和PA生物合成的影響。結果顯示，吐溫-80是最合適的一種氧載體，且發酵48 h后在10 L反應器中添加1.0%（體積分數）吐溫-80，可使菌絲在繼續發酵168 h后PA產量達到989.52 μg/L，比未加吐溫-80的發酵體系提高25%[73]。余夢瑤等開發了兩種茯苓固體發酵菌質，兩者在發酵茯苓60 d后都可得到較高產量的PA[74]。Jin Jian等通過液相色譜-質聯用手段對天然茯苓（茯苓皮和茯苓肉）和發酵菌絲體所含物質和含量進行比較，結果發現發酵菌絲體中PA含量為0.61 mg/g，顯著高于天然茯苓[75]。以上研究結果都說明，通過對茯苓菌進行發酵和工藝技術改進有可能提升PA含量，因而發酵培養手段有希望成為傳統提取手段的一種較好替代方案。

Shu Shaohua[76]、陳杰[77]等研究發現茯苓菌絲在三萜化合物（包括PA）含量顯著高于菌核，因此對兩者進行了比較轉錄組學研究，結果顯示甲羥戊酸途徑是茯苓中三萜化合物唯一生物合成途徑，而且一些關鍵基因在菌絲階段差異性表達造成了三萜化合物含量的差別；在此基礎上，劉影[78]結合液相色譜-質譜聯用技術對菌核提取物進行了定性和定量分析，從中發現了5種與PA碳骨架一致的化合物，分別為羊毛甾醇、栓菌酸、16α-羥基栓菌酸、齒孔酸（依布里酸）和土莫酸，并由此預測了從羊毛甾醇到PA的生物合成途徑（圖2）。在該預測途徑中，由栓菌酸生成土莫酸的途徑需進一步確定，因為根據郭繼云等報道的茯苓甾醇C-24甲基轉移酶（Poria cocossterol C-24 methyltransferse，PcSMT）1基因實際功能來看，其催化栓菌酸24 位碳原子甲基化生成齒孔酸[79]，因而據此可推測土莫酸應先由栓菌酸生成齒孔酸，然后再由齒孔酸16位碳原子羥基化生成土莫酸，但在劉影[78]的檢測結果中不僅發現了齒孔酸，還發現了16α-羥基栓菌酸，因此，土莫酸還可能存在先由栓菌酸在16位碳原子上羥基化生成16α-羥基栓菌酸，再由16α-羥基栓菌酸24位碳原子甲基化得到土莫酸的合成路徑（圖2）。此外，隨著對PA生物合成途徑的不斷解析，陸續有研究團隊對該途徑中一些重要步驟的催化酶類進行了基因克隆和功能分析（表4）。以上研究成果為將來利用合成生物學和代謝工程方法改造茯苓或其他工程微生物，進而利用發酵培養手段大規模生產PA奠定了一定的理論基礎。

圖2 PA生物合成途徑預測Fig. 2 Predicted pachymic acid biosynthesis pathway

表4 PA生物合成途徑中已克隆的酶基因及其功能分析Table 4 Cloned enzyme genes in pachymic acid biosynthesis pathway and their functional analysis

4 茯苓在保健食品、藥品領域的應用

目前，單以PA作為主要成分的保健食品和藥品鮮有相關報道，但以茯苓作為主要成分的產品則較多，故對茯苓相關藥品和保健食品進行總結，擬從側面評估PA在大健康領域的應用價值和前景。通過檢索國家特殊食品信息查詢平臺（http://ypzsx.gsxt.gov.cn/specialfood/#/food）可以獲知，截至2021年8月，已有118種茯苓相關保健產品得到了批準文號，其涵蓋了免疫調節、睡眠改善、疲勞緩解、腸胃改善等多種保健功能（圖3）。此外，通過檢索國家藥品監督管理局藥品查詢系統，可以發現茯苓常作為原料參與一些中成藥的制備，這些中成藥多以丸、片、膠囊、顆粒等劑型出現。以上有關茯苓藥品和保健食品研發的報道，為日后進一步在醫藥和食品領域開發PA奠定了基礎。

圖3 茯苓在保健食品領域的應用Fig. 3 Application of P. cocos in healthcare products

5 結 語

“十方九苓”說明茯苓的中醫臨床應用廣泛，藥理作用多樣，而以PA為代表的茯苓三萜同樣展現多樣的藥理活性。基于本文所綜述的研究現狀，筆者認為在醫藥與保健食品領域PA的基礎研究和開發利用還有以下問題值得深入探討。

首先，在未來較長一段時間內，以茯苓作為原料進行PA提取依然是PA的主要獲取途徑，因此在茯苓的規范化種植、加工處理、飲片炮制、提取方法和工藝等方面的創新將有助于PA產量的提升。例如，李習平等考察了不同加工處理方式對茯苓和茯苓皮中PA含量的影響[83]，其結果提示PA對熱壓不穩定，故在今后改進或創新茯苓的加工處理、飲片炮制、提取方法和工藝時，要防止長時間的高溫高壓對PA的破壞。

其次，作為食藥同源材料茯苓的功效成分，圍繞腫瘤防治、睡眠改善和血糖降低等功能食品需求，開發以PA或茯苓為組方的保健食品或特醫食品具有很好的前景。比如，由于PA不僅可直接抑癌還可協同化療和放療進行間接抗癌，故針對癌癥病人開發以PA為主要成分，或直接以茯苓為主料開發增敏化療或放療作用的特醫食品，已經具備一定的科學性和可行性。此外，中醫記載茯苓具有寧心安神功能，而現代藥理研究證實PA具有鎮靜催眠作用，因此研發以PA或茯苓為主要原料，用于改善失眠狀況的保健食品具有一定的科學依據，其在安神助眠功能性保健食品中必定具有良好的應用前景。

最后，PA的生物合成途徑已逐漸得到解析，負責催化這些代謝途徑的酶類也漸漸被發掘和驗證，這為利用基因工程手段提高PA產量奠定了基礎，但到目前為止鮮有通過改造茯苓菌自身生物合成途徑提高PA產量的直接研究，也鮮有通過異源構建PA完整生物合成途徑代謝生成PA的報道，因此在PA生物合成研究上應積極解決這些基礎研究問題，從而早日實現利用代謝工程方法大規模生產PA的愿景。

綜上所述，食藥同源材料茯苓所含的PA具有多樣的藥理活性，是潛在的保健食品或特醫食品的功能活性成分。基于PA與茯苓整體藥理作用具有很強的相類性規律，以PA為代表的茯苓三萜類成分，很有可能成為繼茯苓多糖后在食品領域新的研究熱點。