含ACC脫氨酶的根際促生菌對(duì)切花月季生長(zhǎng)及生理的影響

李文祥，張?zhí)熘{，賈顏，劉松，李茜，倪功，黃海泉，黃美娟

（1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224；2.云南錦苑花卉產(chǎn)業(yè)股份有限公司，云南 石林 652208）

切花月季（Rosa hybrida）為薔薇科薔薇屬常綠、半常綠花卉，作為世界四大鮮切花之一備受消費(fèi)者喜愛(ài)，具有良好的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。‘伊芙伯爵’作為切花月季品種，具有花量多、花朵大、花型美、重瓣性強(qiáng)的特點(diǎn)，并帶有濃濃的老玫瑰花香，深受人們的喜愛(ài)，但其生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，目前生產(chǎn)實(shí)踐中常通過(guò)大量施用化肥、農(nóng)藥來(lái)提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，久而久之易造成土壤板結(jié)、養(yǎng)分失衡和環(huán)境污染等問(wèn)題，不僅影響切花月季的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且對(duì)人類(lèi)健康及生存環(huán)境構(gòu)成極大的威脅［1］，生產(chǎn)過(guò)程中兼顧生態(tài)效益對(duì)于該產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。對(duì)根際生態(tài)中的植物-土壤-微生物互作過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn)，植物根際促生菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)，還能夠改良土壤中的微生態(tài)環(huán)境，因此不僅能提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)，而且有利于減少化肥、農(nóng)藥等的施用［2］，降低生產(chǎn)成本及環(huán)境污染。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是對(duì)植物根際有益微生物的統(tǒng)稱(chēng)，能與植物相互作用，從而改善植物生長(zhǎng)［3-6］。其中，含ACC（1-氨基環(huán)丙烷羧酸）脫氨酶的PGPR可分解ACC（乙烯合成直接前體）［7］，減少乙烯生成，延緩植物衰老，在干旱、重金屬等逆境條件下能顯著提高農(nóng)作物的抗逆性和產(chǎn)量。如宋金秋等［8］從絞股藍(lán)種植土壤中分離到7株具ACC脫氨酶活性的細(xì)菌，其中表現(xiàn)最優(yōu)的菌株可使水稻幼苗的根長(zhǎng)提高1.6倍，根鮮重增加。Khalifa等［9］在鹽生植物根際分離出兩面神菌屬、芽孢桿菌屬和枯草芽孢桿菌屬共3株產(chǎn)ACC脫氨酶菌株，接種小麥后均能顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)。Santana等［10］發(fā)現(xiàn)接種根際促生菌芽孢桿菌能緩解干旱導(dǎo)致的高粱光合速率降低。然而，目前尚未見(jiàn)將含ACC脫氨酶的PGPR應(yīng)用于切花月季栽培中的研究報(bào)道。本研究以市場(chǎng)上熱銷(xiāo)的切花月季栽培品種‘伊芙伯爵’為材料，研究具有ACC脫氨酶活性的PGPR對(duì)其生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響，篩選出對(duì)其有促生作用的菌株，從而為切花月季環(huán)境友好型生物菌肥的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選到的具ACC脫氨酶活性的7株菌，具體信息見(jiàn)表1。長(zhǎng)勢(shì)一致的‘伊芙伯爵’切花月季扦插苗由云南錦苑花卉產(chǎn)業(yè)股份有限公司提供，苗高約10 cm。

表1 含ACC脫氨酶的菌株信息

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌懸液制備 挑取ADF固體培養(yǎng)基（ACC為唯一氮源）中的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5后于4℃、8000 r/min離心15 min，收集菌體，并以原體積無(wú)菌水重懸，得到單菌的菌懸液。混合菌液為7種單菌菌懸液以等比例混合而成。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將多菌靈原粉按8～10 g/m2的比例拌入栽培基質(zhì)（草炭土、黃土、珍珠巖以10∶3∶2比例混合而成）中進(jìn)行消毒殺菌，并晾曬3天，采用無(wú)紡布種植袋（35 cm×30 cm）種植月季扦插苗，緩苗一個(gè)月后，對(duì)其根部進(jìn)行菌懸液澆灌處理，設(shè)置單菌F195組、F105組、F11組、F23組、L11組、L74組、Z22組及混合菌液Mix組8個(gè)處理，每袋澆灌50 mL菌懸液與800 mL無(wú)菌水，以純無(wú)菌水澆灌作為對(duì)照（CK），每個(gè)處理4株，重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

于菌懸液處理第60天，測(cè)量月季株高、莖粗、分枝數(shù)、花徑、葉綠素相對(duì)含量（SPAD）、葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量和花朵乙烯釋放量（ethylene production，EP），并對(duì)光合作用指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.1 SOD、POD、CAT活性和MDA含量的測(cè)定 參考高俊鳳［11］的方法測(cè)定。

1.3.2 SPAD及葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定 選取上、中、下部葉片，使用葉綠素儀（SPAD 502，精度0.1 SPAD）測(cè)定葉綠素相對(duì)含量。利用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（IMAGING-PAM，S/N：IKEB0261，IMAG-CM，德國(guó)）在葉片暗適應(yīng)30 min后，測(cè)定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和表觀光合電子傳遞效率（ETR），并計(jì)算最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）。

1.3.3 葉片光合特性的測(cè)定 采用LI-6400 XT便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)（內(nèi)置專(zhuān)用紅藍(lán)光源葉室）在晴天9∶00—11∶30及15∶30—17∶00選擇植株頂部生長(zhǎng)點(diǎn)向下第3～5片功能葉測(cè)定氣孔導(dǎo)度（Gs）、凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），并計(jì)算水分利用效率（Pn/Tr）。

1.3.4 花朵乙烯釋放量的測(cè)定 利用便攜式乙烯分析儀CI-900測(cè)定單朵花在5 min內(nèi)的乙烯釋放量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較（α=0.05），用Microsoft Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’主要農(nóng)藝性狀的影響

如表2所示，所有菌株處理的月季株高均顯著高于對(duì)照，以F195菌株處理的最高，達(dá)68.1 cm，較對(duì)照增加56.91%，菌株F105處理的次之，L11菌株處理的最低，但仍高于對(duì)照23.73%。除Z22菌株處理的月季莖粗顯著低于對(duì)照外，其余菌株處理的莖粗均與對(duì)照差異不顯著，僅F23處理的莖粗略高于對(duì)照。除F105和F11外，各菌株處理的分枝數(shù)均略高于對(duì)照，但未達(dá)差異顯著水平，其中混合菌株處理的分枝數(shù)最多，顯著高于F105處理。各菌株處理的花徑均與對(duì)照無(wú)顯著差異，僅F23菌株處理的略大于對(duì)照。可見(jiàn)，含ACC脫氨酶的各菌株能夠顯著促進(jìn)月季‘伊芙伯爵’的株高增長(zhǎng)，但對(duì)莖粗、分枝數(shù)和花徑的影響較小。

表2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’主要農(nóng)藝性狀的影響

2.2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’葉片MDA含量及葉綠素相對(duì)含量的影響

PGPR菌株處理能降低‘伊芙伯爵’葉片的MDA含量，提高葉綠素相對(duì)含量（圖1）。混合菌株處理對(duì)MDA含量的降低幅度最大，F(xiàn)23和F195次之，分別為對(duì)照的63.58%、72.52%和77.32%，差異達(dá)顯著水平。各單菌處理能增加葉片中的葉綠素含量，其中F195菌株處理的SPAD值顯著高于對(duì)照12.87%，而混合菌株處理的SPAD值略降低，但與對(duì)照差異不顯著。

圖1 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’葉片MDA含量及葉綠素相對(duì)含量的影響

2.3 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’花朵乙烯釋放量與葉片抗氧化酶活性影響

從圖2可以看出，混合菌株和單菌Z22處理能夠促進(jìn)‘伊芙伯爵’花朵的乙烯釋放，但與對(duì)照差異不顯著；其余菌株處理均能減少花朵的乙烯釋放量，尤以F195菌株處理的減幅最大，乙烯釋放量?jī)H為對(duì)照的64.54%。除L11和Z22菌株處理略降低SOD活性外，各單菌和混合菌株處理均能提高月季葉片的抗氧化酶活性，其中，F(xiàn)195菌株處理的SOD、POD、CAT活性分別顯著高出對(duì)照38.64%、58.45%、1.17倍，F(xiàn)11菌株的SOD活性顯著高出對(duì)照42.03%，其余菌株處理均與對(duì)照差異不顯著。

圖2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’花朵乙烯釋放量及葉片抗氧化酶活性的影響

2.4 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’光合特性的影響

從表3可以看出，相比于對(duì)照和各單菌處理，混合菌株處理降低了‘伊芙伯爵’葉片的Pn、Gs、Ci和Tr，與對(duì)照差異達(dá)顯著水平。各單菌處理中，與對(duì)照相比，F(xiàn)11菌株顯著提高了Pn，達(dá)到對(duì)照的1.07倍，而F105、F23、L74、Z22均顯著降低了Pn；F195菌株處理顯著提高了Gs，達(dá)到對(duì)照的2.15倍；F195、F105、F11、F23菌株處理顯著提高了Ci，分別是對(duì)照的1.25、1.17、1.19、1.25倍，其余菌株處理與對(duì)照差異不顯著；F195、F11、F23顯著提高了Tr，分別高于對(duì)照75.8%、49.5%、24.2%，而其余菌株處理均顯著降低了Tr。菌株L11和混合菌株顯著提高了‘伊芙伯爵’的水分利用效率，增幅分別為50.0%和42.6%，而F195、F11、F23菌株處理的水分利用效率均顯著低于對(duì)照，其余菌株處理則與對(duì)照差異不顯著。

表3 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’光合特性的影響

2.5 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

從表4可以看出，與對(duì)照相比，施入不同PGPR單菌或混合菌對(duì)月季葉片的Fv/Fm、qP無(wú)顯著影響，但顯著降低ΦPSⅡ；除F195菌株處理的qN外，PGPR處理降低qN和ETR，其中L11和Mix的qN顯著低于對(duì)照，除F195、F23、L74外的其余菌株處理ETR均顯著低于對(duì)照。綜合來(lái)看，菌株處理后，各熒光參數(shù)均沒(méi)有顯著高于對(duì)照，表明PGPR菌株處理對(duì)光合作用的提高可能并不直接來(lái)源于對(duì)葉綠素?zé)晒馓匦缘母纳疲谴嬖谄渌麢C(jī)制。

表4 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對(duì)‘伊芙伯爵’葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>

3 討論與結(jié)論

植物與存在于其生活環(huán)境中的微生物有著緊密聯(lián)系，長(zhǎng)久的進(jìn)化使其在植物生長(zhǎng)和逆境適應(yīng)中扮演著不可或缺的角色。已有研究揭示，PGPR存在多個(gè)機(jī)制刺激植物生長(zhǎng)，包括能進(jìn)行生物固氮作用［12，13］、合成激素（IAA、GA3以及細(xì)胞分裂素等）［14］、對(duì)抗病原菌［15，16］、產(chǎn)鐵載體［17］、具有解磷能力［18-20］等。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株處理對(duì)‘伊芙伯爵’株高都有顯著促進(jìn)作用，這與舒健虹［12］、戚秀秀［21］等的研究結(jié)果類(lèi)似。另一方面，含ACC脫氨酶的PGPR能夠降解ACC為α-酮丁酸和氨，使乙烯低于抑制植物生長(zhǎng)的水平，最終達(dá)到促生長(zhǎng)的效果，一般表現(xiàn)為根系數(shù)量的增加，進(jìn)而促進(jìn)其適應(yīng)和生存［22，23］。本試驗(yàn)中，菌株F195處理后的月季花朵乙烯釋放量顯著低于對(duì)照，在提高抗氧化酶活性方面也表現(xiàn)出了較其他菌株處理更好的效果，并顯著降低了MDA含量。這可能與菌株F195擁有最高的ACC脫氨酶活性相關(guān)。

光合作用貫穿于植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段并最終決定植物的生產(chǎn)量［24］。本研究中，與對(duì)照相比，菌株F195、F11和F23處理后的葉片蒸騰速率顯著提高，而水分轉(zhuǎn)運(yùn)以及植物吸收地下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)依靠蒸騰作用，并且植物光合作用和氧化代謝中多余的熱能也是通過(guò)蒸騰作用散出。菌株F195也顯著提高了其氣孔導(dǎo)度，氣孔張開(kāi)度的增加有利于大氣中的CO2進(jìn)入，從而進(jìn)一步促進(jìn)光合作用的進(jìn)行及植物的生長(zhǎng)，這與內(nèi)生細(xì)菌對(duì)芳樟光合特性的影響［25］結(jié)果相似。然而，菌株處理雖然都顯著增加了株高，但僅菌株F11處理的凈光合速率顯著高于對(duì)照，胞間CO2濃度、蒸騰速率也均顯著高于對(duì)照，這可能與其處理后的葉綠素含量較高有關(guān)；另外，F(xiàn)195菌株處理的氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率也均顯著高于對(duì)照，凈光合速率略低于對(duì)照，但差異不顯著，說(shuō)明植物的凈光合速率不僅與葉片厚度、成熟度、光合色素含量等密切相關(guān)，還會(huì)受到外部環(huán)境因素如溫度和光照強(qiáng)度等的影響［26］。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)能反映出植物光合作用的內(nèi)在復(fù)雜過(guò)程［27-30］。秦嗣軍等［29］利用從野生東北山櫻根際分離到的3株P(guān)GPR菌株接種盆栽東北山櫻幼苗，發(fā)現(xiàn)接種臘質(zhì)芽孢桿菌對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)無(wú)影響，而接種松鼠葡萄球菌后，幼苗的最大光化學(xué)效率增強(qiáng)。但Paradi等［30］在不同梯度磷養(yǎng)分條件下用叢枝菌根真菌聚生球囊霉接種長(zhǎng)葉車(chē)前，得到叢枝菌根真菌對(duì)長(zhǎng)葉車(chē)前最大光能轉(zhuǎn)換效率影響不顯著的結(jié)論。本研究結(jié)果也表明，接種含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株也不能顯著提高切花月季的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，有的菌株甚至?xí)a(chǎn)生顯著的抑制作用。

綜合來(lái)看，接種植物促生菌可以使切花月季‘伊芙伯爵’株高增加，分枝增多，葉綠素含量增加，花朵乙烯釋放量減少，對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。目前普遍認(rèn)為，PGPR對(duì)植物生長(zhǎng)的影響是間接的，通常是通過(guò)改善土壤理化特性來(lái)提高根系對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育。這種間接作用可能才是接種PGPR菌株顯著提高切花月季株高的主要原因。此外，本試驗(yàn)使用的菌株來(lái)自于不同的屬，如假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、芽孢桿菌屬，均是植物根際促生菌的主要來(lái)源屬［31-33］。探索更多屬菌株的促生作用將有助于植物根際促生菌資源的豐富及開(kāi)發(fā)利用。