金黃色葡萄球菌表面蛋白與生物被膜關系的研究進展

關曉雯 田 雨 魏蓮花

1.甘肅中醫藥大學公共衛生學院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院檢驗中心，甘肅蘭州 730000

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一種革蘭氏陽性球菌，它是引起人類感染性疾病的重要病原菌之一，大約有30%的健康成年人攜帶SA，主要定植在皮膚和黏膜表面[1]。它不僅可以引起毛囊炎、結膜炎、肺炎等局部化膿性感染，還可以引起膿毒癥、敗血癥等全身感染。從20世紀80年代開始，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）在全球范圍內蔓延，以至于許多國家現在報告醫院中感染SA 分離株的MRSA 占比超過50%[2]。SA 的毒力因子包括黏附性分子、蛋白酶類、免疫逃逸因子和毒素類[3]，其中識別黏附基質分子的微生物表面成分是最大的一類，這些表面蛋白具有許多功能，包括黏附和侵入宿主細胞和組織，逃避免疫反應和生物膜的形成[4]。因此，細胞壁錨定蛋白是SA 在共生狀態和侵入性感染期間生存的必要毒力因子。有研究表明，由SA 引起的慢性生物膜相關感染通常會導致發病率和死亡率顯著增加，尤其是在與留置醫療器械相關的情況下。將生物材料植入患者體內后，機體會迅速通過由宿主來源的細胞外基質蛋白組成的調節膜將其覆蓋[5]。SA 與細胞外基質蛋白的結合是由識別黏附基質分子的微生物表面成分（microbial surfaces components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMS）介導的，這些宿主蛋白質中的一些可以作為細菌附著的受體，因此顯然可以在生物膜發育的早期發揮重要作用。

1 生物膜

生物膜的形成是許多細菌病原體的重要毒力機制，它可以定義為微生物來源的固著群落[6]，其典型特征是細胞附著在基質、表面或彼此之間，包埋在細胞外聚合物質的基質中，并在生長、基因表達和蛋白質產生方面表現出表型的變化[7]。雖然參與細菌生物膜形成的分子成分因細菌種類而異，但一個被廣泛認可的基本模型由三個連續的階段組成：①細菌附著于表面；②生物膜的形成和成熟；③生物膜分離和擴散[8]。為了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 細胞首先附著在生物或非生物表面，然后增殖成稱為小菌落的粘性聚集體（也稱為塔或蘑菇狀結構）[9]；附著到表面后，在有足夠營養源的情況下，黏附的SA 開始分裂和積累，為營養物交換和廢物去除提供表面積的增加，并促進生物膜細胞向遠端部位的擴散[10]，這個時期，將其稱之為增殖階段；SA 生物膜的擴散在很大程度上被證明是在基因調節器（accessory gene regulator，Agr）群體感應系統的控制下進行的，活化的Agr 介導的群體感應通過蛋白酶活化和/或酚可溶性調節蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）產生啟動生物膜基質調節和細胞擴散[11]。生物膜在慢性感染的持續性中起著重要作用，它的形成會將細胞包裹在聚合物基質中，降低了對抗生素和免疫防御的敏感性，使這些感染難以根除[12]，并且在感染期間，細胞從生物膜上擴散可導致傳播到次要部位，并使感染惡化。

2 表面蛋白與生物膜的關系

2.1 Ebh 蛋白和SasF 蛋白

為了在生物材料上形成生物膜，浮游SA 細胞首先利用對不同宿主基質底物特異的多種細胞壁錨定蛋白附著在表面[13]。大多數先前已經被表征的配體結合蛋白被發現與細胞壁相關，并且被稱為MSCRA MMs[14]，如細胞外基質結合蛋白（extracellular matrixbinding protein homologue，Ebh）。Lei 等[15]使用蛋白質組學的方法，利用骨科植入物相關的大鼠模型，直接從感染的骨植入物中鑒定生物膜基質蛋白。結果證實，急性感染時，受感染骨組織中存在兩種表面相關蛋白Ebh 和SA 表面蛋白F（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasF）。Ebh 出現在分泌蛋白質組和表面蛋白質組的急性感染期，也出現在慢性感染期的分泌蛋白質組中；SasF 是在慢性分泌組中發現的另外一種表面蛋白。為了驗證上述蛋白確實存在于感染期間的生物膜基質中，他們使用針對兩種表面蛋白Ebh 和SasF 的抗體進行免疫組織化學分析[16]。結果顯示，Ebh在急性和慢性感染的分泌體中均被鑒定，相比之下，SasF 僅在慢性分泌體中發現，并且Ebh 和SasF 均在感染組織中表達，而在感染其等基因突變的組織中不表達。這就意味著Ebh 和SasF 是生物膜基質的組成部分[15]。

2.2 SasG 蛋白

SA 表面蛋白G（surface protein ofStaphylococcus aureus，SasG）與表皮葡萄球菌生物膜形成所需的積累相關蛋白（biofilm-associated accumulation-associated protein，Aap）密切相關[17]。SasG 和Aap 依賴的生物膜形成是最容易理解的生物膜形成過程。Aap 可促進生物膜形成的初級附著或積累階段[18]，具體取決于所研究的菌株。在這兩種蛋白的調控下，生物膜的積累依賴于鋅，鋅與Aap 的G5-E 結構域結合，從而促進兩個Aap 多肽的橋聯[19]。此外，Aap 的G5-E 結構域會形成扭曲的繩狀結構，當連接到其他細胞的Aap 蛋白質時，可以將細菌連接在一起，如圖1所示。在SasG 調控的生物膜積累過程中可能會出現類似的機制[20]。

圖1 CWA 蛋白在生物膜形成中的作用

2.3 FnBPs 蛋白

對于纖維連接蛋白結合蛋白（fibronectin-binding proteins，FnBPs）介導的生物膜形成，需要N2-N3 子域[21]。N2-N3 亞結構域通過對接、鎖定和閂鎖（dock，lock and latch，DLL）機制與配體結合。然而，DLL 不參與FnBPA 介導的生物膜，因為表達缺乏閉鎖肽的FnBPA 突變株仍然形成生物膜[22]。此外，FnBPA 配體結合區域中的天冬酰胺殘基對于DLL 的配體結合至關重要，可以在不減少生物膜形成的情況下進行替換[23]。FnBPs 也可以通過主要自溶蛋白（the major amidase，Atl）和替代sigma 因子（alternative sigma factors，sigB）調節的重要作用來決定生物膜的形成[24]，并且和其他表面蛋白通過嗜同性蛋白質-蛋白質相互作用或通過與鄰近細胞上的其他配體結合促進聚集。這將有助于設計MRSA 生物膜形成過程中發生的蛋白質-蛋白質相互作用的抑制劑，從而降低某些疾病的發生率[25]。

2.4 ClfB 蛋白

在某些SA 菌株中，在缺乏Ca2+的條件下生長，生物膜的形成取決于聚集因子B（clumping factor B，ClfB）[26]。這是一個特別的蛋白質，因為其他生物膜介質受到Ca2+消耗的抑制，ClfB 有助于黏附和定植到鼻道中的鱗狀上皮細胞[27]。在生物膜相關感染的臨床分離株和SA 的實驗室菌株中，生物膜相關基因的表達可能受到不同的調節因子的影響[28]。例如，MRSA 菌株通常在Agr 基因型或表型上呈陰性。此外，蛋白酶可以調節表面蛋白質依賴性生物膜的形成。ClfB 介導的生物膜形成已被證明適用于金黃色素編碼基因失活的菌株，因此這種表型可能僅限于在aur 基因中存在功能缺失突變的菌株[29]。

2.5 Bap 蛋白

Bap 基因編碼了一種2276 個氨基酸的新型生物膜相關蛋白（biofilm associated protein，Bap），它是第一個能夠誘導生物膜形成的表面蛋白[30]。該蛋白與革蘭氏陰性（銅綠假單胞菌和傷寒沙門氏菌）和革蘭氏陽性（糞腸球菌）微生物的表面蛋白具有全局組織相似性[31]。Bap 的核心區域占蛋白質的52%，由13 個連續的幾乎相同的重復序列組成，每個重復序列包含86 個氨基酸。所有攜帶Bap 的葡萄球菌菌株都具有高度的黏附性和強大的生物膜生產者[32]。而且在小鼠感染模型中，Bap 參與了發病機制，導致了小鼠機體的持續感染。Bap 是SA 副基因組的一部分，但其他葡萄球菌中Bap 的同源基因屬于核心基因組。它的主要作用是促進非生物表面的黏附，并通過自組裝成淀粉樣聚集體誘導細胞間強烈黏附，以響應環境中的鈣水平和pH 值。在感染過程中，Bap 可增強與上皮細胞的黏附力，直接與宿主受體Gp96 結合，并抑制細菌進入細胞[33]。

3 討論

SA 和表皮葡萄球菌是難以用抗生素治療的醫療器械相關感染的重要原因。在進化過程中，它們獲得了一系列毒力特征，使其能夠在生物和非生物表面定植，形成生物膜結構[34]。事實上，這是一種高度有序的結構，具有大量的蛋白質定位和組分之間的相互作用，從而形成一層堅固的保護性生物膜“涂層”[35]。其中，基質的結構成分主要是多糖和蛋白質的混合物，其中許多蛋白質已被證明能聚合成更高級的結構。SA 的纖維連接蛋白結合蛋白種類繁多，它們在定植和感染過程中扮演重要的角色，從而在宿主內表達多種功能[36]。深入了解表面蛋白介導的生物膜形成的機制基礎將有助于設計與生物膜積累有關的蛋白質-蛋白質相互作用的特定抑制劑。近年來，嚴重生物膜感染的出現及其對抗菌治療的耐藥性給醫學領域帶來了巨大挑戰[37]。因此，本文強調了分泌蛋白和CWA 在SA 生物膜形成和致病性中的獨特作用，這可能為控制葡萄球菌生物膜感染提供理論依據和防治策略。