非小細胞肺癌癌組織和癌旁組織的環狀核糖核酸表達水平與診斷價值分析

劉成英 農雪萍

江西省胸科醫院病理科，江西南昌 330000

肺癌是臨床常見且嚴重的惡性腫瘤疾病，該病的診斷率較高、致死率較高，嚴重危害人類的身體健康[1]。目前有研究表明，環狀核糖核酸（circular ribonucleic acid，circRNA）能夠明顯表達出肺癌的進展情況，在高通量測序的不斷更新換代下，更多的研究和文獻提出circRNA 通過異常顯著差異表達來表示肺癌的進展情況[2]。相關研究表明circRNA 與細胞的增殖、侵襲和分化等生物過程均有一定關系，因此了解circRNA有作為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）新生物標志物的潛能[3]。本研究分析NSCLC 癌組織和癌旁組織的circRNA 表達水平與診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2021年5月江西省胸科醫院收治的12 例NSCLC 患者的病理組織標本，采集的標本需要經過冰凍切片處理，通過組織HE 染色表現出癌細胞占比≥70%；選取病理組織外側5 cm 位置癌旁組織作為對照樣本，該標本中癌細胞占比應為0，通過免疫組化ABC 染色顯示陰性。其中男8 例，女4 例；平均年齡（62.64±7.62）歲；鱗癌7 例，腺癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期2 例；分化程度低度8 例，中度4 例；吸煙或戒煙患者7 例，不吸煙患者5 例。收集同期47 例NSCLC 患者與47 例健康體檢者血清，予以檢測血清circRNA。NSCLC 患者中，男34 例，女13 例；平均年齡（61.52±6.45）歲。健康體檢者中，男33 例，女14 例；平均年齡（61.38±6.67）歲。NSCLC 患者與健康體檢者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。受試者或家屬簽署知情同意書。納入標準：①年齡≥18 歲；②NSCLC 患者經過病理診斷確診[4]；③術前血常規、心電圖、肝功、腎功全面檢查后均符合手術標準；④健康人員無癌癥病史及家族史、無放化療史，可配合完成血清circRNA 檢查。排除標準：①臨床資料不全者；②TNM 分期不明確者；③合并其他惡性腫瘤者；④術前進行放化療治療患者；⑤治療、檢查依從性差者；⑥健康人員檢查相關功能存在異常，有血清circRNA 檢查禁忌。

1.2 方法

1.2.1 癌組織和癌旁組織檢測 ①應用TRIzol 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientife 公司）提取12 例患者癌組織和癌旁組織的總RNA，將RNA 置于230、260、280 nm 位置，測量吸光度數值，對濃度及純度進行測算和評估。使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法測量RNA 的純度和完整性。②應用RNaseR（美國Epicentre 公司）排出組織中總RNA 的線性RNA。應用Super RNA Labeling（美國Arraystar 公司）將RNA 當中的cDNA 予以擴增并顯示熒光。③排列雜交已經染色的組織與Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（美國Arraystar 公司），在清洗液試劑盒（美國Agilent公司）中徹底清洗。④使用circRNA 芯片（中康博生物科技公司）予以檢測、收錄圖像、處理數據等干預，

1.2.2 血清檢測 采集NSCLC 患者及健康體檢者清晨空腹肘靜脈血5 ml，進行離心處理，貯存血清備用。隨后使用TRIzol LS 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientife 公司）提取血清中的總RNA。利用分光光度計測量RNA 濃度。將RNA 反轉錄成cDNA，將cDNA 進行熒光定量PCR。circRNA 引物為正向引物（F）：ACGAGGCATGGCCAAGATTT，反向引物（R）：TTGATACTAGAGCCCGCTGCC；GAPGH 正向引物F：GAGT CAACGATTTGGTCGT，反向引物（R）：GACAAGCTTCGCGTTCTCAG。引物序列設計和合成廠家為Cellcook（中國廣州）。circRNA 的相對表達數值使用2-ΔΔCt表示。試驗次數=3。

1.3 觀察指標及評價標準

circRNA 癌組織和癌旁組織異常表達；circRNA聚類分析；血清circRNA 表達水平與臨床指標相關性；NSCLC 的circRNA 診斷價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗；使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析NSCLC 患者血清circRNA 的診斷價值，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）；利用G2505c 基因芯片掃描儀（美國Agilent 公司）掃描組織熒光情況，使用Agilent Feature software 軟件分析數據，在R 平臺上統一數據類型，篩選表達異常的circRNA，制作出火山圖，隨后進行聚類分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circRNA 癌組織和癌旁組織異常表達

在R 平臺當中，通過DESeq2 軟件共篩選出癌組織和癌旁組織中表達差距明顯的circRNA 共194 個（癌組織表達水平：癌旁組織表達水平≥2 或≤-2），差異有統計學意義（P＜0.05）。制作出火山圖（圖1，封四），其中121 個顯示上調（紅色部分），73 個顯示下調（藍色部分）。

2.2 citcRNA 聚類分析

通過對癌組織和癌旁組織的標本中circRNA 的表達數量大小不同進行聚類分析，癌組織及癌旁組織的circRNA 表達量不同，circRNA 能夠清晰分辨NSCLC 癌組織和癌旁組織。繪制聚類分析圖，紅色表示circRNA 表達量相對高，綠色表示表達量相對低（圖2，封四）。

2.3 血清circRNA 表達水平與臨床指標相關性

不同性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分化、病理類型、癌癥分期NSCLC 患者的circRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 血清circRNA 表達水平與臨床指標相關性（±s）

表1 血清circRNA 表達水平與臨床指標相關性（±s）

注 circRNA：環狀RNA

臨床特征例數circRNAt 值P 值性別0.066 0.947男女34 13 2.95±0.52 2.94±0.24年齡（歲）≤60＞60吸煙情況吸煙或戒煙不吸煙腫瘤分化中高度分化低分化病理類型鱗癌腺癌癌癥分期Ⅰ～Ⅱ分期Ⅲ～Ⅳ分期0.418 0.678 16 31 3.04±0.56 2.96±0.65 1.777 0.082 25 22 3.06±0.24 2.87±0.47 0.542 0.590 31 16 2.97±0.56 2.87±0.67 0.885 0.381 26 21 3.04±0.56 2.88±0.68 0.598 0.553 28 19 2.98±0.65 2.87±0.57

2.4 血清circRNA 診斷NSCLC 的效能

NSCLC 患者的血清circRNA 表達水平高于健康體檢者，差異有統計學意義（t=6.676，P＜0.001）。ROC曲線（圖3）顯示，血清circRNA 診斷NSCLC 的靈敏度為82.98%，特異度為61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879）。

圖3 血清circRNA 診斷NSCLC 的ROC 曲線圖

3 討論

隨著人口增長、環境變化，肺癌的發病率與死亡率也在不斷升高，即便目前針對肺癌有最新研究的靶向治療和相關的免疫療法，但是患者的五年生存率依舊難以提升[5-6]。circRNA 是一類不具備5’末端帽子和3’末端poly（A）尾巴，內含共價鍵構成環形結構的非編碼RNA 分子[7-8]。circRNA 能夠代表一類新類型的保守內源RNA，具有調節動物基因表達的作用[9]。

本研究結果顯示，NSCLC 患者癌組織和癌旁組織的異常表達的circRNA 中有121 個上調，73 個下調，提示circRNA 可能具有促進癌癥發生和進展的效果。通過聚類分析來分辨癌組織和癌旁組織，可在一定程度上發揮補充火山圖的優勢[10-11]。此外，本研究結果還顯示，NSCLC 癌組織和癌旁組織的在circRNA表達方面存在一定差異，故能夠借助血清circRNA 對NSCLC 進行診斷，通過血清circRNA 對NSCLC 診斷的ROC 曲線圖可見，血清circRNA 診斷NSCLC 的靈敏度為82.98%，特異度為61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879），提示血清circRNA 具有較高的診斷價值。

本研究推測circRNA 會促進疾病進展，并且通過癌組織的檢測結果進行證明，其可信度較高。circRNA的來源主要是組織細胞壞死調往后，會通過囊泡釋放到血液當中，產生循環游離的RNA，因此血清circRNA 的水平高，并且血清中的囊泡存在circRNA 的富集，因此circRNA 在癌組織以及血清當中的表達水平具有一定的相關性，今后可針對血清circRNA 的來源進行進一步探究[11-13]。因此在對NSCLC 患者進行診斷的過程中，可以通過檢測血清circRNA 進行無創檢查，可能會提高診斷的準確性[14]。血清circRNA 表達水平與患者臨床指標相關性的結果顯示，不同性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分化、病理類型、癌癥分期NSCLC 患者的circRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），原因可能是病例數過少，或者病例選擇存在偏頗[15]。

綜上所述，circRNA 在NSCLC 癌組織和癌旁組織的表達具有明顯不同，利用血清circRNA 診斷NSCLC 的準確率較高，circRNA 水平可能在一定程度上體現病情。