腹膜透析患者超濾衰竭相關(guān)外泌體來源miRNA的初步篩選

吳旭 吳煒飛 程志群 范德墉

隨著人口老齡化進程加速，世界范圍內(nèi)慢性腎臟病（chronic kidney disease,CKD）的發(fā)病率逐年上升。我國流行病學(xué)調(diào)查研究顯示成人CKD的患病率為10.8%，其中腎臟替代治療患者以每年11.0%以上的幅度遞增[1]。腹膜透析作為腎臟替代治療的主要方式之一使用率逐年上升。超濾衰竭是腹膜透析常見的并發(fā)癥，是導(dǎo)致腹膜透析失敗轉(zhuǎn)血液透析的重要原因之一[2]。隨著腹膜透析齡的增長，超濾衰竭的發(fā)生率逐漸增高。外泌體是由活細胞分泌的直徑為30～150 nm的小囊泡，廣泛存在于血清、血漿、唾液、尿液、羊水以及其他生物體液中[3]。miRNA是一類重要的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，長度為18～24個核苷酸，通過與靶mRNA特異性結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[4]。研究表明，miRNA參與腹膜纖維化的發(fā)生，導(dǎo)致超濾衰竭，患者不得不退出腹膜透析[5-8]。而外泌體能夠攜帶并遞送miRNA至靶細胞進而影響細胞的生物學(xué)行為，其參與炎癥、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而調(diào)節(jié)多種病理生理過程，并且其雙層膜結(jié)構(gòu)能夠保證miRNA在體液中的穩(wěn)定性[9]。因此外泌體來源的miRNA更適合作為疾病的生物標志物。基于此，本研究通過檢測腹膜超濾衰竭患者腹膜透析流出液（peritoneal dialysis effluent,PDE）中外泌體來源miRNA的差異表達譜，探尋可能與腹膜透析超濾衰竭相關(guān)的重要miRNA，以期進一步闡明腹膜超濾衰竭的發(fā)生機制，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2000年1月至2019年11月在湖州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科規(guī)律隨診的腹膜透析患者30例。排除標準[10]：（1）患者臨床資料不全；（2）入組前 3個月內(nèi)有腹膜炎病史；（3）伴有腹腔出血；（4）合并有腫瘤或嚴重的心、肝、肺疾病；（5）正在使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑。其中15例患者腹膜平衡試驗提示超濾衰竭，為觀察組，另15例患者腹膜平衡試驗提示無超濾衰竭，為對照組。超濾衰竭判斷標準：4.25%葡萄糖透析液留腹4 h后超濾量＜400 ml[2]。本研究經(jīng)湖州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（批件號：20191002-01），患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者性別、年齡、置管日期、原發(fā)病、24 h尿量、腹膜透析相關(guān)性感染總次數(shù)、有無糖尿病、有無高血壓病等一般資料。

1.2.2 臨床指標檢測 （1）血生化指標：采集患者清晨空腹靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血肌酐、血尿素氮、血尿酸、血清白蛋白、TC、血清校正鈣、血磷、全段甲狀旁腺激素（intact parathyroid hormone,iPTH）、Hb、CRP。（2）總尿素清除指數(shù)（Kt/V）及殘余腎功能：通過PD Adquest 2.0軟件計算總Kt/V；殘余腎功能（ml/min）=（尿肌酐/血肌酐+尿尿素氮/血尿素氮）×24 h尿量×7×0.5[11]。（3）腹膜功能：采用標準腹膜平衡試驗評估腹膜功能,具體方法如下：患者做腹膜平衡試驗的前夜進行標準的連續(xù)性不臥床腹膜透析治療；試驗當(dāng)天，患者取坐位，在20 min內(nèi)將昨晚留腹的腹膜透析液引流出來，計量。然后患者取臥位，將2 000 ml透析液灌入腹腔，以此定為0 h，在透析液腹腔保留0 h和2 h，收集透析液標本，從腹腔內(nèi)引流出200 ml液體倒入液袋，上下顛倒2～3次，搖勻后抽取10 ml液體測定肌酐和葡萄糖濃度，剩余的190 ml液體重新灌入腹腔；留腹2 h，抽取血標本，送檢血肌酐；留腹4 h后，患者取坐位，用20 min排空腹腔內(nèi)的透析液，稱重并計量，將透析液袋倒轉(zhuǎn)2～3次，搖勻后抽取10 ml液體，檢測4 h的 PDE的肌酐與葡萄糖。計算0 h、2 h、4 h透析液與血液中肌酐的比值；計算2 h、4 h與0 h透析液中葡萄糖濃度的比值[2]。

1.2.3 外泌體的分離與鑒定 實驗委托上海研載生物技術(shù)公司進行。兩組患者中隨機各抽取3例，收集其500 ml留腹過夜的PDE，4℃超速離心法分離外泌體[12]。具體如下：將PDE以300 g離心10 min，3 000 g離心15 min，12 000 g離心30 min，小心吸取上清液至新管中，去除細胞或細胞碎片。用0.22 μm過濾器過濾，12 000 g離心60 min，去除上清液，留下外泌體粗提沉淀。用PBS重懸沉淀，10 000 g離心60 min，仔細去除上清液，保留的沉淀用200 μl PBS重懸以獲得外泌體。

參照Jan等[13]的方法鑒定外泌體。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)及納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis,NTA)技術(shù)檢測外泌體大小[14-15]。具體如下：將重新懸浮的5～10 μl外泌體溶液（預(yù)先用2.5%戊二醛固定）滴加到銅網(wǎng)上，室溫吸附5 min左右，然后向銅網(wǎng)上滴加10 μl染色液（飽和醋酸雙氧鈾溶液），在室溫下對外泌體染色處理1 min，在銅網(wǎng)上滴加雙蒸水后室溫靜置5 min，重復(fù)1次，將銅網(wǎng)在室溫下晾干，上透射電子顯微鏡觀察。外泌體的大小和顆粒密度是通過NanoSight NS300納米粒徑分析儀（英國Malvern Panalytical公司）進行測量。樣品在PBS中稀釋。使用1×1013個顆粒/ml校準珠對外泌體制劑的密度進行歸一化。采用Western blot法鑒定外泌體表面標志物熱休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）、CD63和CD81蛋白[16]。配制 10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠，融解RIPA裂解液，加入苯甲基磺酰氟。加入等體積裂解液，置于冰上放置30 min，每隔10 min搖勻1次，充分裂解外泌體。將蛋白液與上樣緩沖液一起混勻后，放入100℃水浴5～6 min，離心，放置冰上，待上樣。恒壓電泳上層膠60 V，30 min，下層膠110 V，120 min，電泳結(jié)束后需要將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，孵育一抗[CD81（武漢愛博泰克生物科技有限公司）、CD63（英國 Abcam 公司）、HSP70（美國 Proteintech公司）均按1∶1 000稀釋]，4℃搖床，過夜，洗滌緩沖液洗膜3次，用結(jié)合辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1 h，洗膜后使用電化學(xué)發(fā)光試劑在超敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司）下顯影。

1.2.4 外泌體來源miRNA高通量測序與分析 實驗委托上海研載生物技術(shù)公司進行。參照試劑說明書，使用 RNAiso Plus試劑（日本TAKARA公司）從外泌體中提取總 RNA。每250 μl外泌體樣品加入750 μl Trizol裂解，然后加入200 μl氯仿分離液。在上層液體中加入異丙醇，從外泌體懸浮液中沉淀RNA。用75%乙醇懸浮，4℃ 12 000 g離心5 min。將沉淀溶解在20 μl焦碳酸二乙酯中。通過計算260 nm與280 nm的光密度（OD）比值評估 RNA純度。TruSeq miRNA樣品制備試劑盒（美國Illumina公司）用于 RNA文庫構(gòu)建。 通過 ACGT101-miR軟件（美國LC Sciences公司）進行數(shù)據(jù)預(yù)處理。隨后根據(jù)miRbase數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/）從PDE外泌體中鑒定出miRNA。應(yīng)用DESeq算法篩選差異表達的miRNA，即以1，偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜0.05為標準。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，兩組比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較 兩組患者性別、原發(fā)病、有無合并糖尿病或高血壓及Hb、CRP、TC、血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血清校正鈣水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與對照組相比，觀察組患者年齡大、透析齡長、首次透析時間早、腹膜透析相關(guān)性感染總次數(shù)多、腹膜轉(zhuǎn)運特性為高轉(zhuǎn)運比例高，血白蛋白、總Kt/V及殘余腎功能均偏低，血磷及iPTH均偏高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.2 PDE外泌體分離后鑒定結(jié)果 NTA結(jié)果顯示，檢測的粒子直徑為50～150 nm，峰值主要集中在142 nm（圖1）；Western blot檢測結(jié)果顯示，所提取的外泌體的蛋白條帶與陽性對照條帶分子量相同，外泌體特異性表達 HSP70、CD63和 CD81蛋白（圖 2）；透射電子顯微鏡觀察可見PDE來源的外泌體外形呈橢圓形（圖3）；熒光染色結(jié)果顯示，PDE來源的外泌體能成功被腹膜間皮細胞攝取（圖4，見插頁）。

圖1 PDE外泌體顆粒直徑和濃度分布的NTA結(jié)果

圖2 外泌體HSP70、CD63和CD81蛋白表達電泳圖（1：陽性對照；2：本研究所提取的外泌體）

圖3 透射電子顯微鏡下外泌體的形態(tài)（×100 000）

圖4 共聚焦激光顯微鏡觀察到PKH67標記外泌體被腹膜間皮細胞攝取（×800）

2.3 兩組患者PDE外泌體來源miRNA的差異表達情況 高通量測序結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組PDE外泌體中存在70個有明顯表達差異的miRNA，其中41個表達上調(diào)，29個表達下調(diào)(圖5，見插頁)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。表達上調(diào)、下調(diào)差異倍數(shù)前19位的 miRNA見表2。

表2 兩組患者PDE外泌體來源差異miRNA表達譜

圖5 兩組患者PDE外泌體來源miRNA表達差異火山圖

3 討論

隨著腹膜透析技術(shù)的不斷發(fā)展及我國政府的大力支持，腹膜透析已成為我國終末期腎臟病（end-stage renal disease,ESRD）患者成熟的腎臟替代治療方式之一[17]。其優(yōu)勢在于能連續(xù)清除毒素、較少影響患者活動和較低的治療費用。然而，持續(xù)暴露于葡萄糖透析液、機械應(yīng)力、導(dǎo)管并發(fā)癥等均可引起腹膜的炎癥與損傷，從而促使腹膜經(jīng)歷漸進性血管生成和纖維化，促使腹膜有效表面積改變、葡萄糖滲透轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下降，最終導(dǎo)致超濾衰竭[18]。外泌體來源miRNA在細胞間物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)遞中至關(guān)重要，參與炎癥、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而可能調(diào)節(jié)多種病理過程[19]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，觀察組患者年齡大、透析齡長、首次透析時間早、腹膜透析相關(guān)性感染總次數(shù)多、腹膜轉(zhuǎn)運特性為高轉(zhuǎn)運比例高，血白蛋白、總Kt/V及殘余腎功能均偏低，血磷及iPTH均偏高，這與陳嫚等[17]和Sumi等[20]的研究結(jié)果相符。兩組患者PDE外泌體來源miRNA進行高通量測序，并通過生物信息學(xué)分析，統(tǒng)計miRNA顯著差異表達情況。結(jié)果顯示，觀察組PDE外泌體中顯著差異表達的miRNA共有70個，其中hsa-miR-125a-3p_R-1、hsa-mir-1273c-p3、hsa-miR-132-3p等 41個表達上調(diào)，hsamiR-708-5p、hsa-miR-155-5p_R-1、bta-mir-2904-2-p5等29個表達下調(diào)，這說明與對照組相比，腹膜透析超濾衰竭組PDE外泌體來源miRNA表達譜發(fā)生了明顯的變化。

miR-125a、miR-1273g-3p、miR-708-3p 和 miR-155-5p參與臟器纖維化已有相關(guān)文獻支持。例如，He等[21]研究顯示miR-125a在人酒精和丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化組織和CCL-4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織中的表達均高于正常對照組。使用miRNA微陣列的研究表明，miR-1273g-3p在丙型肝炎病毒相關(guān)肝纖維化患者中表達上調(diào)[22]。特發(fā)性肺纖維化患者的血漿和組織樣本中，miR-708-3p的表達水平是降低的。microRNA-708-3p通過調(diào)節(jié)ADAM17-GATA/STAT3軸，阻斷肺纖維化[23]。亦有研究表明，miR-708在肝纖維化組織中表達是下調(diào)的[24]。miR-155-5p通過抑制SIRT1信號通路促進梗阻性腎病的腎間質(zhì)纖維化[25]。因此推測上述miRNA在逆轉(zhuǎn)腹膜纖維化方面可能也有類似作用，而腹膜纖維化是導(dǎo)致腹膜透析超濾衰竭的常見原因之一，故上述miRNA也可能參與腹膜超濾衰竭。

綜上所述，腹膜透析超濾衰竭患者外泌體來源miRNA表達譜發(fā)生明顯改變。腹膜透析超濾衰竭患者的PDE外泌體存在多種miRNA表達的失調(diào)，提示miRNA可能參與腹膜超濾衰竭的發(fā)生。筆者團隊下一步將對這些差異表達的miRNA進行靶基因的預(yù)測及功能分析，進一步探討腹膜透析超濾衰竭的發(fā)生、發(fā)展機制，以期尋找新的防治方法。