加味四君子湯對燙傷腸黏膜及炎癥因子的影響

許志俊，羅錦花，詹劍華，程興，黃凱

（南昌大學第一附屬醫院燒傷科，南昌 330006）

在機體遭受嚴重的打擊后往往最先引發腸道的感染。 腸道感染可能導致敗血癥和MODS，在這些情況下，腸源性感染被認為是主要的死亡原因。腸道菌群與黏膜固有免疫力之間的相互作用會受到嚴重干擾。 先天性免疫失調，微生物群失調和細菌易位似乎會形成正反饋回路，共同導致嚴重疾病中不可控制的炎癥反應和敗血癥等并發癥[1]。 腸道黏膜免疫屏障在機體免疫系統至關重要。四君子加味湯可以明顯加強腸道黏膜免疫，調節腸道菌群[2]。患者燒傷程度越深，面積越大，持續時間越久，引起血清炎性因子TNF-α 明顯增加[3]。 四君子湯是我國中醫經典的補益劑，常用于臨床胃腸道疾病。人參、茯苓、白術和甘草組成傳統的四君子湯，而本研究使用黨參替代人參， 并增加黃芪和薏苡仁用來增強其對腸道黏膜的保護及抗炎作用。 加味四君子湯對腸道功能的保護， 可能是通過降低炎癥因子來實現的。 因此本實驗在30% TSBAIII 度燙傷兔模型上， 觀察嚴重燙傷后腸道屏障功能及炎癥標記物， 討論不同濃度的加味四君子湯對其的影響，并找到最佳療效濃度及所需時間。

1 材料與方法

1.1 加味四君子湯制備 中藥：黨參300 g、白術300 g、茯苓350 g、甘草150 g、黃芪300 g、薏仁200 g，藥材來源于南昌大學第一附屬醫院。把中草藥一起放入藥鍋中先用0.9% NaCl 5000 mL 浸泡30 min 后，再加入0.9% NaCl 5000 mL 煮沸后小火熬60 min，濾去殘渣，可得藥液320 mL,生藥濃度為5.0 g/mL，4 ℃保存，用蒸餾水配比出不同濃度的藥液分組實驗。

1.2 動物分組、處理與制模

1.2.1 動物分組及處理 90 只兔， 重2.0 kg 左右，實驗動物購自南昌龍平兔業有限公司，許可編碼：SCXK(jiangxi)2014-0005。隨機分5 組，每組18 只，A 組：自飲水。 B 組：傷后，給予0.9% NaCl 灌胃，10 mL/次，tid。C 組（0.2 g/mL）：傷后，給予0.2 g/mL加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 D 組（1.0 g/mL）：傷后， 給予1.0 g/mL 加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 E 組（5.0 g/mL）：傷后，給予5.0 g/mL 加味四君子湯灌胃，10 mL/次，tid。 在灌胃后第1、3、7 d各6 只用于取樣和檢測。

1.2.2 燙傷組制備 實驗兔稱重后， 用速眠新肌松后再以水合氯醛腹腔麻醉，電動剃須刀背部剃毛，禁食12 h。 第二天，以同樣方法麻醉實驗兔，熱水（90～92℃）燙傷時間設置為20 s，造成30%TSBAIII度燙傷。 燙傷后給予每千克40 mL 的乳酸鈉林格抗休克，用碘伏對創面進行常規消毒，防止創面感染影響實驗觀察。 取兔注入空氣處死， 取回腸黏膜，用0.9% NaCl 漂洗后，放入甲醛中保存，貯存于4 ℃冰箱。

1.3 觀察指標 觀察各組兔燙傷后回腸黏膜組織病理學形態變化情況。 行ELISA 檢測不同組燒傷后第1d、3d、7d 的回腸黏膜中炎癥因子：TNF-α、IL-1β、IL-10。

1.4 統計學分析 應用SPSS 19.0 統計軟件，用（x±s）表示。 三組及以上數據用χ2檢驗，兩組比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組回腸黏膜病理學形態變化 燙傷前可見皮膚正常，傷后2 min 可見皮膚變紅，傷后第1 d，可見水泡形成，皮膚彈性差，傷后第3 d、7 d，見皮膚焦黃，水分基本丟失，分界清晰，硬如皮革。 可見病理學形態改變： 鏡下可見炎性細胞大量彌散在燙傷的組織附近，絨毛結構基本被破壞，組織明顯腫脹及滲出。 A 組：回腸黏膜無明顯改變；B 組：回腸黏膜可見炎性細胞大量彌散在燙傷的組織附近，絨毛壞死，組織腫脹及滲出明顯。 給藥組療效與時間正相關，以D 組（1.0 g/mL）濃度給藥7 d 療效最好。 見圖1。

圖1 回腸黏膜病理學形態變化

2.2 加味四君子湯對回腸黏膜組織中炎癥因子TNF-α 值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組中的TNF-α 值顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與B 比較，第1 d D 組TNF-α 值顯著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高劑量3 個組中的TNF-α 值均明顯下降，與C 組比較，在第1 d D 組TNF-α 值顯著降低；在第3 d、第7 d 的時間點，D 組和E 組中的TNF-α 值表達都顯著降低；與E 組比較，各時間點的D 組中的TNF-α 值都明顯下降，有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。 A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子TNF-α 值基本保持同等水平， 無統計學意義；在B 組，隨著時間進展TNF-α 值逐步上升且在第7 d 達到最高；在D 組和E 組,7 d 內伴隨用藥時間延長TNF-α 值逐步降低, 第7 d 降到最低。

表1 加味四君子湯對回腸黏膜組織TNF-α 水平的影響

2.3 加味四君子湯對回腸黏膜組織中炎癥因子IL-1β 值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組中的IL-1β 值顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與B 組比較，第1 d D 組中的IL-1β 值顯著降低；在第3 d、第7 d，低、中、高劑量組中的IL-1β 值均下降；與C 組比較，在第1 d D 組中的IL-1β 值顯著降低，在第3 d、第7 d，D 組和E 組中的IL-1β值顯著降低；與E 組比較，同一天中的IL-1β 值，D組都顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。 A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子IL-1β值基本保持同等水平， 差異無統計學意義； 在B組，IL-1β 值逐步上升，在第7 d 達到最高峰；在D組和E 組中隨著時間進展IL-1β 值逐漸下降且在第7 d 達到最低。

表2 加味四君子湯對回腸黏膜組織IL-1β 水平的影響

2.4 加味四君子湯對回腸黏膜組織中炎癥IL-10值的影響 在同一天， 與A 組比較，B 組的IL-10值顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與B 組比較，在第1 d，D 組中IL-10 值顯著上升，在第3 d 和第7 d，C、D、E 三個組中的IL-10 值都明顯升高；與C 組比較，第1d，D 組中IL-10 值顯著上升，在第3 d、第7 d，D 組和E 組中的IL-10 值顯著上升； 與E 組比較， 同一天，D 組中IL-10 值顯著上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。A 組中的第1 d、第3 d、第7 d 炎癥因子IL-10 值基本保持同等水平，差異無統計學意義；在B 組，IL-10 值逐步降低，第7 d 達到最低；在D 組和E 組IL-10 值逐步上升，第7 d 達到最峰值。

表3 加味四君子湯對回腸黏膜組織IL-10 水平的影響

3 討論

在遭受到嚴重燒傷的情況下，機體處于應激狀態，供血的重新分布，腸道黏膜缺血導致黏液層形成的黏膜屏障遭到破壞，炎性標記物會增加，腸道的免疫屏障功能同樣遭到破壞[4]。 這兩個屏障的相互作用維持了正常的腸道功能和穩定的腸道環境。 完整的腸道屏障不僅僅可減少各種病原體的入侵，對于內環境動態平衡也起到不可缺失的作用[5]。 嚴重的灼傷可能會導致腸道炎癥因子釋放和氧化應激， 從而導致腸道屏障損傷和腸道功能障礙。 在嚴重燒傷的治療中，需要采取相應療法來減輕全身炎癥反應并控制氧化應激的負擔[6]。 嚴重的燒傷可導致腸道炎癥因子釋放， 第一個損害的免疫器官大多是腸道免疫器官[7]。

四君子湯調控腸道菌群、扶植優勢菌群、增強菌群多樣性和抑制致病菌群繁殖[8-9]。 而本研究中的加味四君子湯以黨參代替人參， 從中醫理論的補虛癥上黨參可替換人參， 并且在免疫促進功能上黨參多糖更具有獨特優勢[10]。之前課題研究表明黃芪多糖可改善腸道的黏膜和增強腸道的免疫細胞S-IGA 分泌[11]。 薏苡仁在中藥理論中有著祛濕利水的作用，可以促進腸道菌群的調節，加快腸道細胞的更新代謝[12]。本課題之前在嚴重燙傷大鼠實驗中發現，各種炎癥因子上升，加味四君子湯（用藥濃度1.0 g/mL）可以減少炎癥因子釋放，抑制炎癥細胞附著腸黏膜上，從而對腸道的黏膜系統起到保護作用[13]。 當前，在中藥監管當局的研究開發中， 關于單一中藥和單體成分的研究在增加，關于復方藥劑的研究卻很少，且不夠充分。 但是，充分發揮復方藥劑中各種藥物的協同效果正是中藥的本質，在實際應用中還有很多優點。

腫瘤壞死因子-α 來自巨噬細胞，常隨炎癥反應而出現。 梁建國[14]等人發現TNF-α 在燒傷后平均第1～3 d 達到高峰，對燒傷患者病情評估、演變及預后具有一定治療指導。 嚴重的燒傷會誘導凋亡細胞因子的大量分泌。 在這些因素中，TNF-α 和NF-κB 被認為是細胞凋亡調節的關鍵。 燒傷可引起 血 清 中 生 成 大 量 的IL-1β、IL-6、MCP-1 和CRP，燒傷后可引發生全身性炎癥反應[15]。傷后IL-1β 可以與TNF-α 可以相互促進加重反應[16]。 IL-10 是人體不可缺失的抗炎因子之一, 對于其他的炎癥因子的合成和釋放有一定促進作用,其還可以抑制單核或巨噬細胞抗原表達、抑制TNF-α 受體的表達及釋放、抑制免疫、 可維持促炎和抗炎因子的動態平穩[17-18]。

綜上所述，檢測到燙傷組中回腸黏膜的TNFα 和IL-1β 的表達水平升高，相反抗炎癥因子IL-10 表達水平下降， 說明燙傷可能刺激腸道炎癥反應，是嚴重燒傷早期腸屏障損害的機制之一。 由本實驗可知， 加味四君子湯用藥濃度為1.0 g/mL 時TNF-α 和IL-1β 值明顯下降，IL-10 值明顯升高，并且這種效果在持續7 d 后效果更佳。也證實加味四君子湯對燒傷后引起的腸道炎癥反應有一定的調控作用， 為尋求改善腸道功能提供新思路，而其對嚴重燙傷兔腸黏膜的作用靶點及相關機制，仍需進一步研究。