參附注射液對幼鼠膿毒血癥急性肝損傷的保護機制

金國強，洪燕，余偉，吳儉，劉赟

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院保健科；2.江西省兒童醫(yī)院兒童保健科；3.南昌大學第一附屬醫(yī)院兒科，南昌 330006）

膿毒血癥是人體對感染反應失調(diào)進而引發(fā)全身性炎癥反應的綜合征。 膿毒血癥患者如果沒有得到早診斷早治療則會進展為嚴重膿毒血癥、膿毒性休克甚至多器官功能不全[1]，進而危及患者生命。 多個臟器的損傷是膿毒血癥的臨床表現(xiàn)之一，研究證實急性肝損傷可發(fā)生在膿毒血癥的早期、中期、晚期等各個階段，發(fā)生急性肝損傷是膿毒血癥預后不好的指標之一， 故此積極的診治膿毒血癥急性肝損傷意義非凡[2]。 參附注射液（Shenfu Injection，SFI）為傳統(tǒng)中藥，在急救患者的臨床應用中效果尚可，由于其作用機制目前研究不多，推廣應用不多。 本研究通過腹腔注射脂多糖構(gòu)建幼鼠膿毒血癥模型， 研究參附注射液對膿毒血癥引發(fā)的急性肝損傷的保護機制。 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 48 只S PF 級幼鼠（4 周齡），雌鼠與雄鼠各占50%，重量范圍為120 g～150 g，由南昌大學江西醫(yī)學院（醫(yī)學部）的動物實驗中心供給，許可證號SYXK-（贛）2010-0002。

1.2 藥物與試劑 脂多糖(LPS， from Escherichia coli 0111:B4, L2603-10 mg)，生產(chǎn)公司：美國Sigma公司。 參附注射液（SFI，Z51020664），生產(chǎn)公司：雅安三九。 兔抗鼠TNF-α 多克隆抗體（BS1857），生產(chǎn)公司：Bioworld。乙酰膽堿試劑盒（Ach，A105-1）,乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶試劑盒(ChAT，A079-1）, 生產(chǎn)公司：南京建成生物工程研究所。

1.3 建立模型及分組 全部幼鼠根據(jù)體重由小到大排號，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為3 組：空白對照組（Ctrl）、膿毒血癥組（LPS）、治療組（SFI）。 各組16只。 進而各組均分成6 h、12 h 亞組，各亞組8 只。根據(jù)預實驗，膿毒血癥組腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）構(gòu)建幼鼠膿毒血癥動物模型[3]。 建模成功后，治療組于60 min 后腹腔注射參附注射液10 mL/kg[4]，其他各組腹腔注射10 mL/kg 0.9% NaCl。

1.4 標本采集 各組于6 h、12 h，10%水合氯醛麻醉后迅速切開腹部，眼球采集血樣并取肝組織。

1.5 肝組織病理學改變 肝組織標本進行脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋，切片，烘干，應用HE 染液染色，封片，貼上標簽，顯微鏡下進行觀察。

1.6 血清ALT、AST、 肝組織TNF-α、 乙酰膽堿水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力測定 生化儀分析結(jié)果測定血清ALT、AST，免疫組化檢測肝組織TNF-α,分別依據(jù)Ach 測定試劑盒、ChAT 測定試劑盒的操作說明書操作測定肝組織Ach 水平、ChAT 活力。

1.7 統(tǒng)計方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用（x±s)表示。樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。 兩組資料之間相關(guān)性分析釆用皮爾森相關(guān)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠肝臟病理變化 Ctrl 組肝細胞的病理形態(tài)正常。在6 h 時LPS 組肝組織出現(xiàn)肝細胞水腫樣變、炎性細胞浸潤、炎性細胞壞死；在12 h 時肝細胞進一步水腫，炎癥細胞進一步增多，壞死進一步加重。SFI 組無論是6 h 還是12 h 肝細胞水腫情況、 炎性細胞浸潤數(shù)量、 壞死程度均較LPS 組減少。 見圖1。

圖1 各組幼鼠肝臟病理變化

2.2 各組幼鼠ALT、AST 及肝組織中的TNF-α 比較 與Ctrl 組相比，LPS 組ALT、AST 及肝組織中的TNF-α 明顯升高 （P＜0.01），12 h 亞組升高更明顯（P＜0.01）。 與LPS 組相比，SFI 組ALT、AST 及肝組織TNF-α 均明顯降低（P＜0.01），但仍高于Ctrl 組（P＜0.01）。 見表1。

表1 各組幼鼠ALT、AST，肝組織TNF-α 比較（n=8，x±s）

2.3 各組幼鼠肝組織乙酰膽堿（Ach）水平、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活力比較 與Ctrl 組相比，LPS 組肝組織Ach 水平、ChAT 活力明顯降低（P＜0.01），12 h 亞組降低更明顯（P＜0.01）。與LPS 組相比，SFI組肝組織Ach 水平、ChAT 活力均明顯升高 （P＜0.01），但仍低于Ctrl 組（P＜0.01）。 見表2。

表2 各組幼鼠肝組織Ach 水平、ChAT 活力比較（n=8，x±s）

2.4 肝組織TNF-α 分別與Ach 及ChAT 的皮爾森相關(guān)分析結(jié)果 肝組織6 h、12 h 時TNF-α 與Ach、ChAT 活力皮爾森相關(guān)性分析，結(jié)果顯示均呈負性相關(guān)（P＜0.01）。 見表3。

表3 肝組織TNF-α 分別與Ach 及ChAT 的皮爾森相關(guān)分析結(jié)果

3 討論

膿毒血癥是兒科重癥監(jiān)護病房、兒科急診及新生兒重癥監(jiān)護病房中常見的危急重癥之一[5]。 據(jù)報道全球每年大約有120 萬名兒童和300 萬名新生兒成為膿毒血癥患者[6]。 兒童及新生兒免疫系統(tǒng)不完善，患有膿毒血癥是對其生命極大的威脅。 肝臟作為最大的解毒器官，調(diào)節(jié)機體的代謝，而膿毒血癥作為全身炎癥反應，肝臟是其靶器官之一。 急性肝損傷發(fā)生在膿毒血癥患者中也屢見不鮮。 曹瑛等報道膿毒血癥急性肝損傷發(fā)病率為28.15%（96/341）[7]。Kobashi H 等報道急性肝損傷發(fā)病率占34.7%[8]。 故此，積極治療膿毒血癥急性肝損傷有著重要的臨床意義。

“炎癥因子瀑布”學說是膿毒血癥造成器官損傷的學說之一。腫瘤壞死因子α（TNF-α）作為炎性因子之一，啟動著膿毒血癥的炎癥反應，進而形成“因子風暴”。膿毒血癥時TNF-α 明顯升高，TNF-α升高的程度是影響膿毒血癥患者預后的危險因子之一[9]。TNF-α 作用于腫瘤壞死因子受體1，兩者結(jié)合形成腫瘤壞死因子受體1 信號復合體，該復合體進一步作用于核因子-κB 信號通路，激活核因子-κB，使其從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與啟動子結(jié)合，促進TNF-α 表達增加，加劇炎癥反應，引起肝細胞壞死、凋亡，造成肝損傷[10-11]。 本研究中膿毒血癥組肝臟TNF-α 表達明顯增加，參附注射液治療組則降低。

膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway， CAP)自提出來后越來越多的學者發(fā)現(xiàn)其在治療膿毒血癥中有著重要的臨床價值。 該通路主要由副交感神經(jīng)、乙酰膽堿(Ach)及α7 煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)組成。 炎癥反應時副交感神經(jīng)受到刺激，釋放乙酰膽堿，釋放的乙酰膽堿與α7nAChR 結(jié)合，再作用于核因子-κB 信號等通路，進一步抑制炎癥因子，調(diào)控著炎癥反應過程[12]。 我國傳統(tǒng)中醫(yī)利用電針足三里穴來刺激副交感神經(jīng)， 激活膽堿能抗炎通路， 證實可抑制炎癥因子TNF-α 分泌，減輕膿毒血癥急性肝損傷等[13]。

乙酰膽堿是通路中主要遞質(zhì)，動物實驗顯示在內(nèi)毒癥老鼠體外補充乙酰膽堿后TNF-α 的免疫活性下降，并且巨噬細胞釋放TNF-α 減少，發(fā)揮了抗炎作用[14]。 在體外乙酰膽堿易被水解，卡巴膽堿作用與乙酰膽堿相似，穩(wěn)定性好。 有研究者體外補充卡巴膽堿，實驗結(jié)果顯示卡巴膽堿通過激活膽堿能抗炎通路，改善臟器血液灌流，對氧自由基的生成進行抑制，保護臟器[15]。 α7nAchR 是通路中主要受體，起著核心作用[16]。實驗顯示應用α7nAchR 受體激動劑可抑制炎癥反應，肝臟KC 細胞作為巨噬細胞的一種，細胞膜上同樣存在α7nAchR 受體，動物實驗顯示煙堿可以抑制肝臟KC 細胞上TNF-α的釋放，抑制炎癥過程[17-18]。

膽堿和乙酰輔酶A 在乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的作用下合成乙酰膽堿。 作為乙酰膽堿的合成酶，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶存在于膽堿能神經(jīng)末梢， 可由非神經(jīng)元細胞分泌,其活性的高低間接提示了機體內(nèi)乙酰膽堿的水平， 維持著機體乙酰膽堿的穩(wěn)態(tài)[19]。本研究中膿毒血癥組的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力明顯降低，乙酰膽堿水平明顯下降。

參附注射液由紅參 （主要成分為人參皂苷）、附子（主要成分為烏頭類生物堿）兩味中藥按照現(xiàn)代方式配制而成，其中人參皂苷可抑制炎癥反應、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫反應、改善臟器的代謝從而發(fā)揮對多個臟器的保護作用。 而烏頭類生物堿有抗炎、抑制細胞凋亡、鎮(zhèn)痛等作用，其毒副作用主要是對心臟的損害[20-21]。 參附注射液是按照現(xiàn)代工藝將人參皂苷和烏頭類生物堿相配伍，大大減少烏頭類生物堿的毒副作用而發(fā)揮兩者有利藥效。在臨床上參附注射液應用于多個系統(tǒng)的病種，如心血管系統(tǒng)的心力衰竭、呼吸系統(tǒng)的肺損傷、消化系統(tǒng)的肝損傷、神經(jīng)系統(tǒng)的腦損傷、休克等疾病[20，22]。 隨著參附注射液在成人多個系統(tǒng)疾病的應用，發(fā)現(xiàn)其副作用小，目前在兒科疾病中也得到多項臨床應用，如支氣管肺炎、腎病綜合征、川崎病等[23-24]。鐘勇等[25]報道參附注射液應用于膿毒血癥急性肝損傷患者可改善患者肝功能ALT、AST、TBIL 水平，降低炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-10 水平，達到治療作用。 本研究中參附注射液治療組血清ALT、AST 同樣明顯降低，肝組織TNF-α 表達降低，動物層面上證實了參附注射液對膿毒血癥急性肝損傷具有保護機制。

參附注射液作為我國傳統(tǒng)中藥，含有生物堿成分，筆者假設(shè)其類似于煙堿、卡巴膽堿等作用于膽堿能抗炎通路。 本研究中參附注射液治療組乙酰膽堿水平升高、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力增加，同時發(fā)現(xiàn)肝組織TNF-α 的釋放與Ach、ChAT 活力呈明顯的負相關(guān)性， 故此參附注射液作用于膽堿能抗炎通路增加乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活力， 升高乙酰膽堿水平，降低炎癥因子TNF-α，保護肝臟。 本研究豐富了參附注射液的臨床應用理論依據(jù)， 對推廣參附注射液的應用有一定的臨床意義。