自動核酸分子雜交鑒別女性HPV 感染患者基因分型的臨床研究

王振峰，王文萍，胡冰

（江西省上饒市人民醫院，上饒 334000）

人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染是最為常見的性傳播性疾病，是誘發宮頸癌的重要原因[1]。 HPV 有多種基因型，不同的HPV 亞型感染其致病性及后果也存在較大差異。 其中低危型HPV（11、42、44型等）感染一般不會誘發癌變；而高危型HPV（16、18、31 型等）感染會造成細胞周期調控失調，導致高度宮頸上皮內病變甚至癌變，故對HPV 感染基因分型的鑒別診斷尤為重要[2-3]。 反向斑點雜交（RDB） 是臨床上最為常用的HPV 分型檢測方法，診斷敏感度及準確性較高，但其操作步驟繁瑣、時間較長[4-5]。 自動核酸分子雜交檢測操作簡便，檢測時間短， 在HPV 基因分型檢測中得到不斷應用。鑒于此， 本文將研究自動核酸分子雜交鑒別女性HPV 感染患者基因分型的臨床價值， 為臨床早期鑒別HPV 感染基因分型提供技術指導。 現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年3 月至2021年3 月于本院進行HPV 分型檢測的71 例女性患者臨床資料?；颊吣挲g21～77 歲，平均年齡（46.91±3.07）歲。 本研究獲醫學倫理委員會批準。

1.2 入選標準 （1）納入標準： ①患者臨床資料較為完善；②患者均有性生活史。（2）排除標準： ①存在子宮切除史或宮頸錐切史；②患有精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 試劑與儀器 選取全自動核酸分子雜交儀（廣東凱普生物科技有限公司提供）、杭州博日擴增儀、BSC-1500IIB2-X 生物安全柜、自動提取儀（廣東凱普生物科技有限公司提供）、 美國UVP HB1000 雜交爐、德國EPPENDORF5810R 離心機；選取HPV 基因分型檢測試劑盒（廣東凱普生物科技有限公司提供） 及配套DNA 提取試劑和雜交試劑等，吸嘴和1.5 mL 離心管（江蘇康健醫療用品有限公司提供）等。

1.3.2 標本采集及處理 將宮頸充分暴露， 通過專用宮頸脫落細胞采集器進行采樣，采集標本后置于2～8℃環境中備測。 標本處理采用自動提取儀及配套提取試劑，在反應試劑槽的第1、7 列加入反應混合液：300 μL 標本+200 μL 溶液1+20 μL 蛋白酶K+200 μL 溶液2，把加樣的反應槽放入設備，開始自動提取。

1.3.3 PCR 擴增 各樣本對應取出1 個反應液管，并做好標記， 將已提取的2 μL 待測樣本DNA 分別加入， 采用相同方法處理陽性質控品及陰性質控品，加樣量均為2 μL，反應總體系為25 μL，采用95℃變性9 min，95℃20 s、55℃30 s、72℃30 s，40 個循環，72℃5 min。。

1.3.4 自動雜交（雜交、洗膜及顯色） PCR 產物置于95℃預變性5 min， 隨后置于冰水混合物中2 min 以上，放于2～8℃冰箱備用；打開儀器，反應室內配件安裝依次為探針膜、硅膠圈和分隔室，雜交試劑盒的各試劑加入儀器對應試劑槽內， 程序開始運行，報警提示后，根據膜條順序依次加入PCR產物， 儀器自動完成雜交過程， 蓋板及硅膠膜揭開，膜條取出保存，判讀試驗結果。

1.4 評價指標 以15 種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 型）陽性作為判斷標準，1 種及1 種以上型別陽性均計為1例，以RDB 檢測結果作為參照，計算自動核酸分子雜交診斷高危型HPV 感染敏感度、 特異度及準確率， 并計算自動核酸分子雜交診斷結果與RDB 診斷結果的一致性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件分析數據，計數資料以百分數和例數表示，用χ2檢驗；一致性采用Kappa 檢驗 （Kappa＞0.75 表明一致性極好，0.40～0.75 表明一致性較為理想，＜0.40 表明一致性差）；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自動核酸分子雜交診斷結果 71 例進行HPV分型檢測的患者經自動核酸分子雜交檢測陽性20例，陰性51 例；以RDB 檢測結果作為參照，自動核酸分子雜交診斷高危型HPV 感染敏感度、 特異度及準確率分別為85.71%、96.00%、92.96%；自動核酸分子雜交診斷結果與RDB 檢測結果一致性極好（Kappa 值=0.829）。 見表1、表2。

表1 自動核酸分子雜交診斷結果（n）

表2 自動核酸分子雜交診斷結果

2.2 自動核酸分子雜交與RDB 檢測HPV 基因型別的一致性 RDB 檢測、自動核酸分子雜交分別檢測15 種高危型HPV，自動核酸分子雜交診斷1 種及2 種HPV 型別與RDB 檢測完全一致共16 例，分型符合率為76.19%（16/21）；其中1 種型別完全相同13 例， 占比為81.25%（13/16），2 種型別完全相同3 例，占比為18.75%（3/16）。 見表3。

表3 自動核酸分子雜交與RDB 診斷完全一致HPV 型別分析

3 討論

HPV 感染主要通過性傳播，一般HPV 感染患者無典型臨床癥狀表現， 但由于HPV 感染與宮頸腫瘤的發生具有密切聯系， 故受到臨床廣泛關注[6-7]。HPV 持續感染為宮頸癌發生的首要條件，大部分HPV 感染患者為一過性感染， 僅有少部分HPV 持續感染患者可能會發展為宮頸癌前病變或宮頸癌[8-9]。 目前已知的HPV 感染有100 多種，可分為低危型HPV 及高危型HPV，其中各型別致病力不同，故對HPV 感染患者的基因分型進行檢測，有利于對宮頸癌高危人群進行識別， 指導疫苗的研發及宮頸癌的防治[10-11]。

RDB 檢測方法作為HPV 感染基因分型檢測的常用方法， 是基于PCR-ASO 技術發展而來的，在基因分型、基因突變檢測方面具有獨特優勢[12-13]。但RDB 檢測中需要經過雜交、洗膜、顯色等過程，且均要手工完成， 操作步驟繁瑣、 人為因素干擾多，檢測耗時長、通量小且效率較低，臨床應用具有一定局限性[14]。自動核酸分子雜交平臺符合檢驗項目自動化發展方向， 用于鑒別HPV 感染基因分型中能夠替代傳統手工操作， 有利于避免交叉感染，保障檢測樣本試驗均一性，進而提高檢測結果穩定性及準確性，避免人為干擾因素，降低操作人員負擔[15]。本次研究中分析自動核酸分子雜交鑒別女性HPV 感染患者基因分型的臨床價值， 研究結果顯示，以RDB 檢測結果作為參照，自動核酸分子雜交診斷高危型HPV 感染敏感度、 特異度及準確率分別為85.71%、96.00%、92.96%；自動核酸分子雜交診斷結果與RDB 檢測結果一致性極好（Kappa 值=0.829）；自動核酸分子雜交診斷1 種及2 種HPV 型別與RDB 檢測完全一致共16 例，分型符合率為76.19%； 其中1 種型別完全相同13例，占比為81.25%，2 種型別完全相同3 例，占比為18.75%。 這提示出自動核酸分子雜交鑒別女性高危型HPV 感染敏感度、特異度及準確率較高，自動核酸分子雜交診斷結果與RDB 檢測結果一致性極好，有利于鑒別女性HPV 感染患者基因分型，能夠將自動核酸分子雜交作為鑒別女性HPV 感染的一種準確方法，以縮短檢測耗時，為臨床早期干預提供參考，進而降低癌變風險，改善患者預后。

綜上所述， 自動核酸分子雜交用于診斷高危型HPV 感染敏感度及特異度、準確率較高，診斷結果與RDB 檢測一致性極好，能夠提高HPV 感染患者基因分型鑒別效能，指導臨床診治。