西藏產綿頭雪兔子的質量標準研究*

王喜錕 萬玉瑩 蘭鈞 次旦多吉 達娃卓瑪**

（1.西藏大學醫學院；2.西藏自治區食品藥品檢驗研究院中藥藏藥質量控制重點實驗室，西藏 拉薩 850000）

綿頭雪兔子屬菊科風毛菊屬植物綿頭雪兔子（Sau?ssurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草，藏文名為“恰果蘇巴”［1］。目前有關綿頭雪兔子的化學成分研究報道，綿頭雪兔子中主要含香豆素類、黃酮類、木脂素類、甾體類、糖類、生物堿類、萜類等化學成分［2-4］。有關于綿頭雪兔子［5-16］的藥理學研究報道，綿頭雪兔子所含的香豆素類、黃酮類、木脂素類等成分與其抗風濕、鎮痛、抗菌消炎、強心、抗損傷、抗氧化及清除自由基、抗癌、終止妊娠等作用有關。另外還有研究報道綿頭雪兔子［17］揮發油成分主要為單萜、倍半萜、脂肪酸及其酯和一些長鏈烷烴、烷醇和烷醛，還有一些芳香化合物等。

雪蓮花現行質量標準收載于《衛生部藥品標準?藏藥?第一冊》（以下簡稱“95部頒”）中，僅收載了性狀及顯微鑒別，質量標準技術低，因此本項目對綿頭雪兔子質量標準進行修訂提高研究，為該藥材質量控制及合理利用資源提供技術指導。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DE；超級循環恒溫水浴箱：山西海金沙科技有限公司，型號：PTC-6；電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器，型號：DHG-9242A；馬弗爐：Yamato，型號：Fo610C；十萬分之一天平：瑞士梅特勒公司，型號：AB204-S；十萬分之一天平：瑞士梅特勒公司，型號：XP504；萬用電爐：北京中興偉業世紀儀器有限公司，型號：DL-1；純水/超純水一體機：默克密理博，型號：Direct 16。

1.2 試藥

本實驗收集到的11批綿頭雪兔子藥材，經西藏自治區藏醫院格桑巴珠副主任藥師鑒定為菊科風毛菊屬植物綿頭雪兔子（Saussurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草。東莨菪內酯購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110768-200504 純度：100%；7-羥基香豆素購自中國食品藥品檢定研究院，批號：111739-200501 純度：100%；色譜純乙腈；色譜純甲醇；自制超純水；分析純甲醇；分析純二氯甲烷；分析純冰醋酸；分析純甲酸。

表1 綿頭雪兔子樣品信息

2 方法與結果

2.1 性狀觀察

本品外形似綿球狀、圓柱狀或圓錐形，表面黃褐色、灰褐色或深灰色。莖長7～25cm,基部有殘存的黑色葉基，呈覆瓦狀密集排列，膜質；莖中部至頂端的葉片密集,皺縮卷曲，密被白色或褐色絨毛。完整葉片卵圓形、匙形、倒披針形或狹倒卵形,邊緣近全緣或齒狀。頭狀花序集生莖頂，呈半圓球形；花冠紫色、白色或紅紫色。稀見瘦果，具白色或黑褐色長冠毛，密集成氈狀，形似灰白色絨球，直徑4～8mm；可見紫紅色或紫黑色的花柱和柱頭露于冠毛外，組成紫灰相間的斑點。氣淡，味微苦、澀。［1］

2.2 顯微鑒別

本品粉末黑褐色，伴有黃褐色棉毛。用水合氯醛透化，稀甘油裝片，置顯微鏡下觀察：非腺毛，極多，均由多細胞組成，粗細均勻，絞成團狀，多已碎短。冠毛多見，軸多細胞組成，單細胞分枝眾多，內層冠毛馬尾狀，單細胞形如非腺毛，但較直；外層冠毛刺毛狀，單細胞短圓錐形。花粉粒眾多，淡黃色，球形或類球形，直徑28.87～43.74μm，外壁有短刺及疣狀雕紋，萌發孔3個。

2.3 薄層鑒別

取綿頭雪兔子藥材粉末1g，加入甲醇50mL，超聲處理60min，濾過，作為供試品溶液。另取綿頭雪兔子對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取東莨菪內酯和傘形花內酯對照品，加甲醇制成每1mL 含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述供試品溶液與對照藥材溶液6～10μL、對照品溶液3μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。結果見圖3。供試品色譜中，在與對照藥材與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.4 水分測定

對照2020 年版《中國藥典》四部通則0832 第二法，共測定11 批次綿頭雪兔子，水分含量最低值6.57%，最高值11.25%（結果見表2），平均值為9.06%.以均值的120%為限，暫定水分限度為不得超過11.0%.

2.5 總灰分測定

共測定11 批次綿頭雪兔子，總灰分最低值7.12%，最高值為17.57%，其中17.57%數據過大，對計算結果影響過大，不予統計，其余數據平均值為9.06%（結果見表2），以均值的120%為限度，暫定總灰分限度為不得超過11.0%.

2.6 酸不溶性灰分

共測定11批次綿頭雪兔子，酸不溶性灰分最低值0.43%，最高值9.94%，其中9.94%數據過大，對計算結果影響過大，不予統計，其余數據平均值為1.52%（結果見表2），以均值的120%為限，暫定酸不溶性灰分限度為不得超過2.0%.

2.7 浸出物測定

熱浸法測定，用水作溶劑，共測定11 批次綿頭雪兔子浸出物，可知11批綿頭雪兔子的浸出物最低值為18.95%，最高值為34.88%（結果見表2），均值為30.37%，以均值的80%為限，暫定浸出物限度為不得少于24.0%.

表2 綿頭雪兔子檢查項以及浸出物含量測定（n=2）

2.8 高效液相色譜法測定傘形花內酯含量

2.8.1 對照品溶液的制備。取經五氧化二磷干燥過夜的傘形花內酯對照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.04mg的溶液，即得。

2.8.2 供試品溶液的制備。取綿頭雪兔子藥材粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，加熱回流1.5h，取出，放涼，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.8.3 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱為Wa?ters XSelect CSH C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-1%冰乙酸溶液（10∶90）；檢測波長為324 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。分別取“2.8.1”項下對照品溶液、“2.8.2”項下供試品溶液以及空白對照溶液（甲醇），按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數按傘形花內酯計不低于3000，并且空白溶液對測定無干擾。說明該方法專屬性好。系統適用性試驗的高效液相色譜圖見圖4。

2.8.4 線性關系考察。精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的傘形花內酯對照品10.22mg，置100mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液，取續濾液1μL、3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL，注入液相色譜儀，測定含量，以傘形花內酯進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標得標準曲線：

傘形花內酯Y=5496817.1652X+10294.5714（R2=0.9998）

表明傘形花內酯進樣量在0.1022～1.3286μg 范圍內與其峰面積積分值有良好的線性關系。

2.8.5 精密度試驗。精密量取0.04896mg/mL 的對照品溶液10μL 注入液相色譜儀，連續進樣測定6 次，記錄峰面積，計算其RSD 值。結果，傘形花內酯峰面積的RSD為0.96%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8.6 穩定性實驗。取XTZ-1 樣品約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h 進樣測定，記錄每次測得的傘形花內酯的峰面積并計算峰面積RSD 值。結果，傘形花內酯峰面積的RSD 為1.84%（n=6），表明該供試品溶液在室溫12小時內穩定。

2.8.7 重復性實驗。取XTZ-1 樣品約0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備方法處理，平行取樣測定6 次，測定峰面積，計算每次測得傘形花內酯的0.5g 相對峰面積的RSD 值。結果，傘形花內酯的0.5g平均相對峰面積RSD為2.19%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.8.8 加樣回收率實驗。取已知傘形花內酯含量的XTZ-7樣品6 份，每份約0.25g，精密稱定，按已知含量（4.26mg/ml）供試品待測成分含量的100%精密加入傘形花內酯濃度為0.02036mg/ml 的對照品溶液50ml（含傘形花內酯1.018mg），按供試品溶液制備方法處理，得相關溶液，進液相色譜儀處理，計算傘形花內酯含量及加樣回收率。結果，傘形花內酯的平均回收率為94.46%，RSD 為0.36%，表明該方法準確度良好。結果如表3。

表3 加樣回收實驗

2.8.9 樣品測定。按“2.8.2”項下制備供試品溶液，分別測定11 批樣品。結果XTZ-1～XTZ-11 傘形花內酯含量依次為1.13%、0.47%、0.25%、0.28%、0.24%、0.25%、0.43%、0.18%、0.24%、0.21%、0.27%（按干燥品計），最高值為1.13%，最低值為0.18%，因XTZ-1 的含量過大，與其他樣品含量相差較大，計入統計影響結果，因此不將其納入統計范圍，其余樣品含量平均值為0.28%，以均值的80%為限度，暫定綿頭雪兔子傘形花內酯含量按干燥品計算，不得少于0.22%.

3 討論

3.1 綿頭雪兔子藥材的檢查項及浸出物含量測定

95部頒中，沒有收載雪蓮花的各檢查項及浸出物項。因此，在本次對綿頭雪兔子的質量標準修訂提高研究中，針對綿頭雪兔子的各檢查項及浸出物進行了研究。各檢查項與浸出物項按照2020 年版《中國藥典》［17］各項規定進行測定。

根據文獻報道［18］，綿頭雪兔子中揮發油含量不高，僅不到1%，因此水分測定選擇了操作簡單的烘干法進行測定。對于浸出物測定項，分別考察了不同濃度的乙醇溶液和純化水，以熱浸法和冷浸法分別提取，比較各組結果，最終發現，用水作溶劑，熱浸法提取，綿頭雪兔子的浸出物最高。

3.2 定性與定量對照物質的選擇

本文通訊作者在對綿頭雪兔子主要成分分析研究［2］過程中發現，香豆素類成分是綿頭雪兔子的主要化學成分，其中東莨菪內酯和傘形花內酯的含量相對較高［3］，因此擬以上述對照品建立薄層色譜鑒別方法，又選擇了含量相對比較高的傘形花內酯，作為綿頭雪兔子含量測定項的指標成分，為綿頭雪兔子及其研制產品質量評價提供科學依據。

3.3 薄層色譜條件的探索

在對綿頭雪兔子的薄層色譜鑒別研究中，參考了有關傘形花內酯的薄層色譜鑒別研究文獻［19］，并參考其他關于薄層色譜鑒別的相關文獻報道［20-22］，最終發現，三氯甲烷-甲醇體系，對于傘形花內酯和東莨菪內酯的展開較好。又考慮到三氯甲烷的毒性相對較大，因此將三氯甲烷更換為二氯甲烷來進行展開，展開條件為二氯甲烷-甲醇（25︰1）。在方法探索過程中發現存在拖尾現象，考慮加入少量的甲酸，以防拖尾，最終確定薄層鑒別展開系統為二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1），在硅膠G板上進行展開。并且，后續又對薄層鑒別項進行了方法學研究，對點樣量、不同規格的薄層板以及在不同濕度溫度條件下進行了展開，發現結果并沒有明顯差異。說明該方法耐用性好。

3.4 HPLC測定方法的探索

在對HPLC 測定方法探索選擇的過程中，筆者對供試品提取方法、提取溶劑以及提取時間做了相應的考察。最終通過所測得的含量結果進行對比，選擇了甲醇回流90min 作為最佳的供試品提取方法。接著，以文獻作為參考［23-28］，考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫、甲醇-1%冰乙酸（30︰70）、乙腈-1%冰乙酸（15︰85）、乙腈-1%冰乙酸（10︰90）幾個系統，根據所得色譜圖結果，綜合考慮出峰時間、分離度等因素，最終選擇以乙腈-1%冰乙酸（10︰90）作為HPLC 測定方法。根據傘形花內酯紫外吸收波長，選擇324nm 作為檢測波長。并且通過方法學考察研究，結果顯示該方法符合含量測定項要求。

綜上所述，本研究就顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物項對綿頭雪兔子進行了測定，建立了綿頭雪兔子中傘形花內酯和東莨菪內酯的薄層色譜鑒別方法，并針對綿頭雪兔子所含傘形花內酯的含量建立了HPLC 測定方法，為西藏產綿頭雪兔子的質量標準修訂提高提供依據，為西藏產雪蓮花的質量控制提供參考。