食管鱗癌干細胞電離輻射抵抗的研究

沈燕如 李磊

（1.西藏大學附屬阜康醫院消化內科；2.西藏大學附屬阜康醫院實驗室，西藏 拉薩 850000；3.鄭州大學人民醫院腫瘤科，河南 鄭州 450000）

2018 年《全球癌癥報告》統計顯示食管癌的全球發病率在惡性腫瘤中位居第7 位，2018 年約有57.2 萬新發病例，死亡病例約50.8 萬［1］。2018 年國家癌癥中心發布的全國癌癥統計數據顯示，2014年在我國腫瘤登記地區食管癌發病率為18.85/10 萬（新發病例約25.8 萬例），同期死亡率為14.11/10 萬（死亡病例約19.3 萬例）［2］。超過90%的食管癌組織學類型是食管鱗狀細胞癌，且超過90%的患者確診時已進展至中晚期［3］。放療及化療是食管鱗癌的重要治療方式，其中紫杉醇是食管鱗癌的常用化療藥物，但紫杉醇耐藥和電離輻射抵抗嚴重影響放化療的治療潛力，因此紫杉醇耐藥機制和電離輻射抵抗的研究可能為食管鱗癌靶向治療提供新方向。近年來，隨著腫瘤干細胞學說不斷進步發展，腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs）被認為是導致腫瘤對放療和化療抵抗的重要原因。本研究中，我們誘導出對紫杉醇耐藥的食管鱗癌干細胞樣細胞，探討CSCs的電離輻射抵抗特性及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及紫杉醇耐藥細胞株的誘導

將人食管鱗癌細胞株EC109 細胞（中科院上海細胞庫）加入含10%胎牛血清（杭州四季青有限公司）、1%谷氨酰胺和100U/mL 青霉素及鏈霉素（華北制藥股份有限公司）的RPMI1640 培養液（美國Gibco 公司），置于37℃、5%CO2培養箱中孵育細胞。每24 小時觀察細胞生長情況，每2 天更換培養液。取EC109細胞，加入0.625μg/mL 紫杉醇（該濃度為紫杉醇對EC109 細胞半數抑制濃度的10 倍余）2 小時，棄培養液。磷酸鹽緩沖液洗3 次，0.25%胰蛋白酶（美國Amresco 公司）消化，離心5 分鐘，棄上清。重新加入RPMI1640 培養液，接種培養瓶中培養。24 小時后去除死亡細胞，擴增活細胞至80%～90%細胞密度，傳代培養3 代。重復上述實驗步驟2 次。然后，增加紫杉醇誘導時間至4 小時，重復上述實驗步驟3 次。最后誘導出紫杉醇耐藥細胞株RR-EC109。

1.2 MTT法檢測耐藥穩定性

將RR-EC109細胞和EC109細胞按每孔7×103個細胞接種于96孔板中（預先每孔加入100μL培養液）。24 小時后，給藥組每孔加入100μL 含0μg/mL、0.0125μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL 和10μg/mL 共8 個濃度梯度的紫杉醇的培養液（每個濃度梯度設6個平行孔）。而對照組每孔加入100μL 培養液。48 小時后，每孔加入20μL四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液（美國Sigma公司），4小時后棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（美國Sigma公司），振蕩10min。采用酶聯免疫檢測儀測定490nm 波長處其光密度OD值。計算不同濃度紫杉醇作用下的細胞半數抑制濃度（IC50）和耐藥指數（RI）。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。后分別在撤藥第30d、60d、90d、120d重復上述步驟。

1.3 成球實驗

配制DMEM/F12 培養液（美國Hyclone 公司），其中表皮生長因子（美國Peprotech 公司）為20ng/mL，成纖維細胞生長因子（美國Invitrogen 公司）為10ng/mL，B27 為1%.取RR-EC109 細胞和EC109 細胞，以每孔5000 個細胞接種于超低粘附6 孔板中（兩種細胞各3孔），每2 天換半量的成球實驗培養液。10 天后，觀察RR-EC109 細胞和EC109 細胞的成球情況，顯微鏡下計數＞20個細胞的細胞球數量。

1.4 克隆增殖實驗

取RR-EC109 細胞和EC109 細胞，每瓶600 個細胞接種到25cm2細胞培養瓶中，RR-EC109 細胞和EC109細胞各3瓶。37℃、5%CO2培養箱孵育，每24小時觀察細胞生長情況。每2 天更換培養液。10 天后甲醇固定細胞，結晶紫染色貼壁細胞，計數＞50 個細胞的克隆細胞數量。

1.5 側群分選

取RR-EC109 細胞和EC109 細胞于培養瓶培養至90%細胞密度，胰蛋白酶消化。離心5 分鐘，加磷酸鹽緩沖液沖洗，重復2次。RPMI1640液（37℃預熱）稀釋細胞至106/mL。將兩種細胞各分為兩組，實驗組：加入維拉帕米液（美國Sigma 公司）至終濃度50uM，30 分鐘后加入Hoechst33342（美國Sigma 公司）至終濃度5μg/mL；而對照組：直接加入Hoechst33342至終濃度5μg/mL。90 分鐘后各加5 倍磷酸鹽緩沖液混勻，離心10 分鐘，加入2mL 磷酸鹽緩沖液。使用流式細胞儀分析各組中側群（Sphere formation，SP）細胞含量。通過Hoechst33342 雙參數分析（藍光450/50nm，紅光660/20nm，紫外激發波長355nm），以紅光為X軸、藍光為Y軸。

1.6 電離輻射抵抗

取對數生長期的RR-EC109 和EC109 細胞，各設假照組及2.0、4.0、6.0和8.0Gy4個照射組，分別按600、1000、2000、6000 和8000 個細胞接種于培養瓶中，每組3 個平行試驗瓶。接種12h 待細胞貼壁生長后，將培養瓶轉移至西門子醫用電子直線加速器產生的6MV X 射線照射，照射劑量率為100cGy/min。照射處理后，更換培養液，放回培養箱繼續培養10d（每3d 更換培養液），棄培養液，使用100%甲醇固定細胞5min，0.5%結晶紫染色細胞5min。顯微鏡下計數各組存活的細胞克隆數目，計算細胞接種效率（PE=假照組實際細胞克隆數/假照組接種細胞數）和照射組細胞存活分數（SF=照射組實際細胞克隆數/（照射組接種細胞數×PE））。

根據實驗所得細胞存活數據建立細胞存活分數與輻射劑量之間單擊多靶模型，通過非線性回歸擬合分析得出擬合曲線方程，表達式為：SF=1－（1－e-kD）n。k：細胞存活曲線的鈍化常數。n：外推數。D0：平均致死劑量（理論上使每個細胞平均被擊中1 次所需要的輻射劑量）。D0=1/k；Dq為準閾劑量（克服單擊多靶曲線中“肩寬”的劑量，代表修復亞致死損傷的能力）。Dq=D0×ln n；D37為細胞37%存活分數時相應的輻射劑量。D37=D0+Dq。SER 為放射增敏比，SERDq是由Dq評價輻射敏感性差異，SERDq=Dq（對照組）/Dq（實驗組）。

1.7 細胞周期調控檢控點基因表達情況

提取RR-EC109 細胞和EC109 細胞總RNA。測定RNA 濃度，鑒定純度及完整性。將RNA 反轉錄合成cDNA。最后進行定量PCR 反應（引物序列見表1），取12.5μL 2×SYBR green I master mix、8.5μL ddH2O、2μL cDNA、1μL 10mM 的正義鏈和1μL 10mM的反義鏈進行PCR 反應。反應條件為95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s（變性和退火重復45次）；最后72℃延伸33s。PCR 反應后馬上進行熔解曲線分析，95℃15s，60℃30s，隨后65℃開始每增加0.5℃保持15s，逐步增加到95℃。采用2－△△Ct法計算基因相對表達量。

表1 定量聚合酶鏈式反應基因引物序列

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 耐藥細胞的誘導

RR-EC109 細胞是通過高劑量間歇誘導+時間遞增的方式誘導，整個過程歷時7個月。加入紫杉醇后，多數RR-EC109 細胞死亡，極少數的RR-EC109 細胞仍貼壁生長。第二階段紫杉醇誘導時間增加至4 小時，死亡細胞明顯減少，恢復增殖狀態加快。

2.2 耐藥穩定性的檢測

RR-EC109 細胞IC50 為（3.578±0.089）μg/mL；EC109 細胞IC50 為（0.068±0.003）μg/mL（P＜0.001）。RR-EC109細胞對紫杉醇RI為67.258，屬于高度耐藥。在誘導結束30d、60d、90d、120d后分別檢測，RR-EC109細胞對紫杉醇的IC50維持在3.5μg/mL左右，RI維持在67左右，顯示RR-EC109細胞的耐藥穩定性良好。

2.3 成球能力

RR-EC109 細胞的成球率（13.2±2.1%）高于EC109細胞的成球率（7.6±1.7%），差異有統計學意義（P＜0.01）（見圖1）。

2.4 克隆增殖能力

RR-EC109 細胞克隆增殖能力為（65.2±4.1%），EC109 細胞克隆增殖能力為（36.8±3.9%），差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖1）。

2.5 側群細胞含量

RR-EC109 細胞中SP 細胞含量為5.8%，EC109細胞中SP 細胞含量為2.3%，差異有統計學意義（P＜0.05）。預先加入ABC 轉運體抑制劑維拉帕米的RR-EC109 和EC109 細胞中基本沒有側群細胞，分別為0.00%和0.04%，與未加維拉帕米組之間差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2）。

2.6 電離輻射抵抗

通過克隆存活實驗比較RR-EC109 和EC109 細胞在不同劑量輻射下細胞克隆增殖能力的差別，結果顯示細胞死亡呈現劑量依賴性。能評價惡性腫瘤細胞放射敏感性的一個重要指標是2Gy 輻射下的平均存活分數SF2，RR-EC109 和EC109 細胞的SF2分別為0.567 和0.483，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。Dq表明細胞受到亞致死損傷后的修復能力，RR-EC109 細胞的Dq值（0.545±0.042）高于EC109 細胞的Dq值（0.367±0.021），差異有統計學意義（P＜0.05）。SER 可評價腫瘤細胞輻射敏感性的差異，SERDq＝0.673±0.214，SERDq＜1 表明RR-EC109 細胞的電離輻射抵抗高于EC109細胞（見表3）。建立單擊多靶細胞存活模型后，通過SPSS 軟件擬合細胞存活曲線（見圖3）。

表2 RR-EC109和EC109細胞在不同劑量輻射下的平均存活分數

表3 RR-EC109和EC109細胞的放射生物學參數

2.7 細胞周期調控檢控點基因表達

檢測RR-EC109 和EC109 細胞中細胞周期調控檢控點基因ATM、ATR、Chk1 和Chk2 的表達情況，結果顯示RR-EC109 細胞中ATM（2.7456±0.1643）、ATR（1.5156±0.0865）、Chk1（2.1689±0.1168）和Chk2（3.4768±0.2268）基因的表達倍數均高于EC109 細胞中ATM（1±0.0870）、ATR（1±0.0392）、Chk1（1±0.0790）和Chk2（1±0.0627）基因的表達倍數（均P＜0.05）（見圖4）。

3 討論

CSCs 是腫瘤中一小群具有長期自我更新及分化成為子代細胞能力的細胞亞群。多想研究證明了乳腺癌、肝癌、腦部腫瘤、肺癌等多種腫瘤的CSCs 的存在［4-7］。CSCs可能是引起腫瘤發生、進展、轉移并對放療和化療抵抗的根本原因。

CSCs 在腫瘤組織或細胞中的含量很少，故CSCs研究的首要問題是如何分離CSCs。目前，分選CSCs的方法主要有流式分選（細胞表面膜蛋白為標志物）、側群分選、無血清懸浮培養、利用細胞中乙醛脫氫酶含量進行分選。也可以利用CSCs 對放療和化療抵抗的特點分選出CSCs。李秋實等［8］和楊婷等［9］通過無血清法培養出食管鱗癌干細胞樣細胞。Zhang等［10］和Lopez-Ayllon 等［11］分別從膀胱癌、肺癌中篩選出對順鉑耐藥的細胞亞群，后者具有自我更新和表達干細胞表面標志物，致瘤性更強等腫CSCs 的特征。本研究采用高濃度間歇誘導法+時間遞增誘導，經過2 個階段，歷時7個月，誘導出人食管鱗癌紫杉醇耐藥細胞株RR-EC109。隨后本研究對RR-EC109 細胞進行鑒定其是否具有CSCs的特征，進而驗證RR-EC109細胞是否為CSCs，從而進行下一步分析。

CSCs因其自我更新能力，能在無血清懸浮培養條件下生長形成腫瘤細胞球，而分化細胞在該條件下會逐漸死亡。所以CSCs 增殖克隆能力會比分化細胞更強。本研究中，RR-EC109 細胞和EC109 細胞模擬無血清懸浮培養條件，接種于超低粘附6 孔板中，隨后RR-EC109細胞顯示出更強的成球能力和克隆增殖能力。目前已有多項研究從不同腫瘤中分離出SP 細胞［12-14］，且研究發現該SP 細胞具有自我更新能力、成瘤能力更強，及高表達干性基因等CSCs 特性。所以可通過SP分選出具有CSCs特性的細胞亞群。本研究中RR-EC109 細胞中SP 細胞含量高于EC109 細胞（P＜0.05），說明RR-EC109 細胞富含SP 細胞，進一步驗證RR-EC109細胞具有CSCs特性，屬于食管鱗癌干細胞樣細胞。

腫瘤患者放療效果取決于腫瘤細胞對電離輻射的敏感程度，但一些腫瘤亞群細胞對電離輻射抵抗，而抵抗機制目前尚不明確。而腫瘤干細胞學說認為CSCs是腫瘤對電離輻射抵抗的重要原因，并由此解釋臨床放療難以根治腫瘤及放療后腫瘤遠期復發或轉移的原因。Bao等［15］發現神經膠質瘤存在一類CD133陽性的亞群細胞對電離輻射抵抗。并且，其后續的研究發現這一亞群細胞具有CSCs 的特性。截至目前，越來越多研究結果表明CSCs 更抵抗電離輻射［16-18］。本研究對RR-EC109 細胞和EC109 細胞進行不同劑量輻射，建立單擊多靶模型，通過非線性回歸擬合分析得出擬合曲線方程，最后得到SERDq＜1，說明RREC109 細胞的電離輻射抵抗高于EC109 細胞；而RREC109 細胞的Dq值高于EC109 細胞的Dq值（P＜0.05），說明RR-EC109細胞的輻射抵抗可能與細胞修復亞致死損傷能力增強有關。

電離輻射對腫瘤細胞的殺傷靶點是DNA，方式有直接作用和間接作用，前者是DNA直接吸收射線能量引起DNA 損傷，后者是DNA 周圍分子吸收射線能量產生活性氧簇，其具有很高的反應活性，可間接引起DNA 損傷［19］。DNA 損傷引起DNA 雙鏈斷裂，斷裂點附近的組蛋白H2AX 蛋白發生磷酸化，形成γ-H2AX，后者能招募DNA 修復蛋白到損傷點，啟動DNA 修復過程［20］。ATM 和ATR 是細胞周期檢控點途徑的重要激酶，其能感知DNA 損傷信號，進而激活一系列磷酸化級聯反應，如細胞周期檢控點效應蛋白激酶Chk1和Chk2 等。Chk1 和Chk2 激活后將損傷信號傳遞到下游，阻止細胞周期進程，引起DNA損傷修復，從而使細胞避免死亡［21］。本研究結果顯示RR-EC109 細胞中ATM、ATR、Chk1 和Chk2 基因的表達倍數高于EC109 細胞且差異均有統計學意義，由此可知RREC109 細胞可能通過表達更高的細胞周期檢控點蛋白引起DNA修復更活躍，導致更強的電離輻射抵抗。

綜上，紫杉醇耐藥細胞RR-EC109具有CSCs的特性，RR-EC109細胞對電離輻射抵抗更強，且其周期檢控點蛋白表達更高，說明CSCs 與放療抵抗有關，可能是通過更高的細胞周期檢控點蛋白引起DNA 修復更活躍來實現的。所以CSCs 電離輻射抵抗的特性可作為治療腫瘤的靶點，但仍需更深入的研究與探索。