百合LhTPS基因啟動子的克隆及序列分析

韓 婷 王 婷 李興桃 杜 方

(山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030800)

萜烯合酶(Terpene synthase，TPS)作為萜烯途徑中最后一步關鍵酶，對各種萜烯類成分的合成具有重要意義。萜烯類物質作為植物體內一種重要的次生代謝物，具有引誘昆蟲授粉和抵御逆境脅迫的作用，也有許多萜烯類物質被用于工業、醫藥和食品行業。小分子的萜烯類化合物還是植物花香揮發物的重要成分，對于刺激消費，提升觀賞植物的商業價值具有不可低估的重要性。

百合是具有高商業價值的觀賞植物，市場上常見的品種多屬于亞洲百合雜種系(Asiatic，A)、東方百合雜種系(Oriental，O)、喇叭百合雜種系(Trumpet，T)以及東方百合和喇叭百合的組間雜種系東喇百合(Orienpet，OT)。其中，亞洲百合常無香，其它種類百合常有香。提升亞洲百合的香味以增加其商業價值是百合育種的目標之一。萜烯類物質是有香百合的主要揮發性成分，已有學者從百合中克隆到與萜烯類化合物釋放相關的

LhTPS

基因，其在濃香型百合中的表達量顯著高于無香型，但基因表達差異形成的原因尚不可知。高等植物基因表達主要由啟動子與轉錄因子之間相互作用進行調控，克隆百合

LhTPS

基因啟動子是解析其基因調控因子及作用機制的前提。目前，已經在百合中克隆到只在雄配子細胞中表達的

LGC1

基因啟動子、與花色形成相關的

CHS

、

ANS

基因啟動子和逆境脅迫誘導型

GPAF

啟動子等，但尚未獲得

LhTPS

基因啟動子序列。本研究利用反向PCR技術在不同百合品種中克隆

LhTPS

基因的啟動子，并利用生物信息學方法比較品種間啟動子序列的多態性和作用元件的差異，為日后進行

LhTPS

啟動子活性和功能分析奠定基礎，也為闡明百合萜類揮發物形成的調控機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料種植于山西農業大學園藝試驗站露天苗圃(112° E，37° N)。選用品種包括亞洲百合‘Pearl Melanie’‘Red Life’，東方百合‘Entertainer’，東喇百合‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’以及喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’。采摘露天苗圃中8個百合品種健康植株的嫩葉，液氮速凍后儲存于-80 ℃超低溫冰箱用于DNA的提取。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取百合幼嫩葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用NanoDrop 2000生物光度計檢測DNA濃度和純度，-20 ℃保存備用。

1.3 反向PCR法克隆‘Red Life’和‘Entertainer’LhTPS基因5′側翼片段

基于已知‘Sorbonne’

LsoTPS

基因組DNA序列(

LsoTPS

-

gDNA

，MH618207)在

Bgl

Ⅱ酶切位點上游設計正向引物IPCR-1F(5′-CAAGTGATGGAGGACGCTAAAG-3′)，在

LsoTPS

基因 5′端設計反向引物IPCR-1R(5′-CTTGGACAACTGACAATGCGAG-3′)。用

Bgl

Ⅱ為內切酶對‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA進行酶切、DNA環化并使用通用型DNA純化回收試劑盒回收DNA。以‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA為模板進行第一次反向PCR，反應體系20 μL，包括PCR Mix 10 μL，IPCR-1F和IPCR-1R 各0.5 μL，gDNA 2 μL，ddHO 7 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性3 min，之后為35個循環的變性(94 ℃，30 s)、退火(56 ℃，30 s)和延伸(72 ℃，2 min)過程，最后在72 ℃ 延伸10 min。PCR產物經膠回收、連接、轉化和篩選等一系列過程送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序序列與‘Sorbonne’

LsoTPS

基因組DNA序列進行拼接，以IPCR-2F(5′-CGGAACACACTTGAAAGGAGAA-3′)和IPCR-2R(5′-TACTCCACCAGAATCAACCCTC-3′)為第2次步移的引物進行PCR，PCR的反應體系和反應程序同第1輪PCR。

1.4 LhTPS基因啟動子的克隆

根據2次反向PCR得到的序列設計正向引物IPCR-LF(5′-CTAGACCGACTCATCATCATCTTCT-3′)和反向引物IPCR-LR(5′-GAAGTGGATGAGATGGGAAGTCG-3′)，用以克隆其它百合啟動子全長序列。反應體系25 μL，包括基因組DNA 2 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 x LA PCR Buffer II(Mgplus)2.5 μL，Takara LA

Taq

0.25 μL，IPCR-LF和IPCR-LR各 0.5 μL，ddHO 15.25 μL。PCR反應程序同上。PCR產物經膠回收、連接、轉化和篩選等一系列過程送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 LhTPS基因啟動子序列分析

利 用 SnapGene(Version 4.2.4)對測序結果進行拼接，獲得每個品種完整的啟動子序列。利用DNAMAN(Version 6.0)軟件分析序列相似性、插入缺失位點和SNP,DnaSp(Version 5.10.01)分析基因多態性系數,MEGA X分析序列進化關系。運用在線軟件PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對啟動子序列進行順式作用元件預測。

2 結果與分析

2.1 LhTPS基因啟動子的獲得

分別以‘Red Life’和‘Entertainer’基因組DNA為模板，經過1次反向PCR擴增在‘Red Life’中得到1條長度約為1 000 bp的序列，但‘Entertainer’中無擴增條帶 (圖1(a))。將‘Red Life’測序后獲得的序列與

LsoTPS

-

gDNA

進行比對，該序列位于

LsoTPS

-

gDNA

翻譯起始位點上游703 bp。為了獲得更完整的表達調控區域，以此序列為模板篩選內切酶和設計引物，繼續以‘Red Life’基因組DNA為模板，使用2次步移的引物進行PCR擴增，獲得1條長度約為1 000 bp的DNA序列(圖1(b))。序列比對結果表明第2次擴增序列與第1次擴增序列有95 bp的重疊區域，位于第1次擴增序列上游693 bp，經2次序列拼接得到起始密碼子上游1 396 bp非編碼序列。根據2次反向PCR得到的序列設計引物IPCR-LF和 IPCR-LR。以IPCR-LF和 IPCR-LR為引物，以‘Pearl Melanie’‘Red Life’‘Entertainer’‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’‘Pink Perfection’‘Orange Planet’DNA為模板進行PCR(圖1(c))，再經連接和轉化等過程，獲得其

LhTPS

啟動子序列。

M，DNA標準DL2 000；1,‘Entertainer’;2,‘Red Life’;3,‘Pearl Melanie’;4,‘Friso’;5,‘Urandi’;6,‘Mister Sandman’;7,‘Pink Perfection’;8,‘Orange Planet’。(a)‘Entertainer’和‘Red Life’ LhTPS啟動子第一次反向PCR結果;(b)‘Red Life’LhTPS啟動子第二次反向PCR結果；(c)8個品種的LhTPS啟動子擴增產物。 M， DL2 000 DNA Marker； 1, ‘Entertainer’； 2, ‘Red Life’； 3, ‘Pearl Melanie’； 4, ‘Friso’； 5, ‘Urandi’； 6, ‘Mister Sandman’； 7, ‘Pink Perfection’； 8, ‘Orange Planet’. (a) The first inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Entertainer’ & ‘Red Life’； (b) The second inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Red Life’； (c) PCR products of LhTPS promoter of 8 lily cultivars.圖1 百合LhTPS基因啟動子的擴增Fig.1 PCR products of LhTPS promoter of lilies

測序結果表明，8個啟動子序列長度為1 376～1 414 bp；最長的為東喇百合系列的‘Friso’‘Urandi’的啟動子序列，均為1 414 bp；最短的為亞洲百合‘Pearl Melanie’的啟動子，僅有1 376 bp；喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的啟動子長短一致，均為1 411 bp(表1)。

表1 不同百合品種基因啟動子的長度
Table 1 Length of gene promoters of lily cultivars

品種Cultivar啟動子Promoter長度/bpSize品種Cultivar啟動子Promoter長度/bpSizePearl MelanieLpmTPS-pro1 376FrisoLfTPS-pro1 414Red LifeLrlTPS-pro1 403UrandiLuTPS-pro1 414Pink PerfectionLppTPS-pro1 411Mister SandmanLmsTPS-pro1 412Orange PlanetLopTPS-pro1 411EntertainerLeTPS-pro1 397

2.2 LhTPS啟動子序列的多態性和系統進化

DNAMAN比對發現，8個序列相似性為90.26%，存在核苷酸多態性位點404個，大于5 bp的插入缺失有6處(Indel 1～6)，插入和缺失主要發生在亞洲百合和東方百合

LpmTPS

-pro、

LrlTPS

-pro和

LeTPS

-pro序列上(圖2)。就每一類群而言，2個亞洲百合間的啟動子序列差異最大(表2)，單核苷酸多態性位點有76個，核酸多態性指數為0.053；2個喇叭百合啟動子序列差異最小，單核苷酸多態性位點僅4個，核酸多態性指數最低，僅0.003；東喇百合單核苷酸多態性位點和核酸多態性指數介于亞洲百合和喇叭百合之間；東方百合因只有一個品種‘Entertainer’，無法計算核酸多態性，故沒有在表2 中列出。

表2 基因啟動子的核酸多態性
Table 2 Nucleotide diversity of promoters

類型Group品種Cultivar單核苷酸多態性位點/個SNP site核酸多態性指數Nucleotidediversity (π)單倍型數量Number ofhaplotype單倍型多樣性Haplotypediversity (Hd)亞洲百合Pearl Melanie,Red Life760.05321喇叭百合Pink Perfection,Orange Planet 40.00321東喇百合Friso,Urandi,Mister Sandman650.03031

以8個百合品種

LhTPS

啟動子核酸序列進行進化樹分析，可將8個品種分為4組，喇叭百合‘Pink Perfection’和‘Orange Planet’的啟動子

LppTPS

-pro和

LopTPS

-pro為T組，東喇百合‘Friso’和‘Urandi’的啟動子

LfTPS

-pro和

LuTPS

-pro為OT組，亞洲百合‘Pearl Melanie’和‘Red Life’的啟動子

LpmTPS

-pro和

LrlTPS

-pro為A組，東方百合‘Entertainer’的啟動子

LeTPS

-pro自成一組，為O組(圖3)。值得注意的是東喇百合‘Mister Sandman’與2個亞洲百合序列相似性更高，也被歸為A組。

2.3 LhTPS基因啟動子順式作用元件

通過PlantCARE對啟動子序列進行順式作用元件分析，發現8個品種的

LhTPS

啟動子都包括核心元件，如TATA-box和CAAT-box，主要負責基因轉錄起始的準確性及高效性；還包括應答元件，如ABRE、ARE、GATA-motif、I-box、G-box、W-box、MYC、TCT-motif和TC-rich repeats等，能被轉錄因子識別和結合，決定基因轉錄的特異性。應答元件又可分為生長發育、光響應、脅迫響應和激素響應四類元件。生長發育類別中，有7種順式作用元件，涉及胚乳表達(AAGAA-motif和GCN4-motif)、芽表達(As-1 element)、晝夜節律(Circadian)、開花(MRE)、衰老(W-box)和玉米醇溶蛋白代謝(O2-site)，其中O2-site占比例最高，為49%(圖4(a))。光響應類別中，有9種順式作用元件，包括G-box、I-box、TCT-motif、GATA-motif、Box4、GT1-motif、TCCC-motif、Chs-CMA1a和ATCT-motif，其中G-box占比最大，為31%(圖4(b))。脅迫響應類別有6種順式作用元件，分別與厭氧誘導(ARE)、防御應激(TC-rich repeats、STRE)、脫水(DRE)和創傷(WRE3和WUN-motif)相關，其中STRE所占的比例最高，為42%(圖4(c))。激素響應類別中的元件包括脫落酸(ABRE、ABRE3a、ABRE4)、生長素(TGA-element)、赤霉素(P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯(MeJA，CGTCA-motif、TGACG-motif、MYC和MYB)和水楊酸(TCA-element、TCA)應答元件，其中響應MeJA的順式作用元件占比最大，為44%(圖4(d))，這可能預示著百合

LhTPS

受MeJA誘導。2個亞洲百合在起始密碼子上游400 bp之內的G-box、CGTCA-motif、MYC作用元件中的序列與其它百合啟動子中的序列不一致，是潛在的研究位點。主要順式作用元件標注于圖2。

A：亞洲百合組；O：東方百合組；T：喇叭百合組；OT：東喇百合組。 A： Asiatic group; O： Oriental group; T： Trumpet group; OT： Orienpet group.圖3 LhTPS啟動子系統進化分析Fig.3 Phylogenetic tree of LhTPS promoters at the gene level

(a)、(b)、(c)和(d)分別表示生長發育、光響應、脅迫響應和激素響應相關順式作用元件數量及占比。

3 討 論

3.1 啟動子克隆方法因基因而異

基于PCR擴增的染色體步移技術提供了克隆已知序列側翼未知啟動子的有效方法，常用的包括反向PCR法、外源接頭介導PCR法和半隨機引物PCR法等。百合基因組大(約36 Gb)，重復序列多，其全基因組數據至今尚未發布，克隆啟動子有一定難度。在百合中，分別采用接頭PCR法、反向PCR法、接頭PCR和FPNI-PCR結合的方法克隆到

CHS

、

ANS

和

GPAT

基因啟動子。本研究前期嘗試過半隨機引物PCR法，但止步于157 bp處。采用反向PCR法首先在‘Red Life’中獲得成功，但在‘Entertainer’中止步于第一步PCR。將克隆到的

TPS

啟動子序列比對南京農業大學滕年軍團隊蘭州百合基因組數據庫(數據尚未發表)，與基因ctg009323_np12121的相似性最高，為89.21%。在引物設計的位置存在多處變異位點(圖5)，可見品種或種不同，基因可能不同，啟動子克隆的方法需在實踐的過程中進行調整。

藍色陰影表示100%的相似性；點表示用于最佳對齊的間隙。 The blue shades represent 100% concordance; The dots indicate the gap for the optimal alignment.圖5 不同材料TPS啟動子序列比對Fig.5 The promoter of TPS from different accessions

3.2 啟動子多樣性可用于系統進化研究和香型分類

基因多樣性是植物在長期適應生存環境和發展進化的過程中獲得的，這種多樣性可能存在于基因的編碼區和非編碼區，存在于核DNA和細胞器DNA。基于核糖體完整葉綠體基因組序列、ITS序列、細胞質基因組序列和其他來自核基因組的分子標記，對百合野生資源和品種所進行的分子系統學研究均基本認同百合野生資源分為Martagon、Sinomartagon、Archelirion、Pseudolirium、Lilium、Leucolirion 和Oxypetalum 7個組，由其衍生出的品種屬于A、O、T、麝香百合(L)、LA、OT和LO等雜種系。本研究獲得了8個百合品種的

LhTPS

啟動子序列，利用這些序列所構建的系統發育樹對所研究百合材料進行分類，其結果與傳統分類結果基本一致，即亞洲百合啟動子聚為一類，喇叭百合啟動子聚為一類，東喇百合啟動子聚為一類，而東方百合啟動子單獨為一類。

TPS

基因負責將底物轉化為萜類物質。雖然本研究并未涉及香氣成分檢測，但在百合香型分類研究中，OT類‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的香型均為Musky scent，A類‘Pearl Melanie’的香型為Faint scented。百合香型分類研究中雖未檢測‘Red Life’的香氣，但事實上研究人員難以察覺到‘Red Life’的味道，因此，可以認為‘Pearl Melanie’和‘Red Life’均為Faint scented香型。可見依

LhTPS

基因啟動子序列的這兩類百合的分類結果與百合的香型分類一致。有趣的是，‘Mister Sandman’雖為OT類百合，但只有部分實驗人員從嗅覺感知到其輕微的香味(Faint scented)，這表明依據啟動子序列將其歸入亞洲百合組也與香型分類一致，也表明‘Mister Sandman’可能與2個亞洲百合有更近的親緣關系，但這樣的結果也可能是由于實驗所用樣本太少造成，需要后續克隆更多材料的

LhTPS

啟動子以進行驗證。

3.3 LhTPS啟動子的多樣性可能影響基因功能

順式作用元件分析表明，8個啟動子均含有負責基因轉錄起始的準確性及高效性、負責生長調控和應激響應的元件。在海島棉、青蒿和鐵皮石斛等物種中均發現

TPS

基因能受到植物激素、蟲害或病害的誘導，認為

TPS

啟動子屬于誘導型啟動子，百合

LhTPS

基因啟動子也可能屬于誘導型啟動子。MeJA作為天然存在的植物生長調節劑，可能參與了揮發性成分等次生代謝物的產生，并在生物和非生物脅迫的防御機制中發揮作用。多個研究表明，啟動子區存在的G-box可以與茉莉酸信號通路的CGTCA或MYC元件互作，從而誘導

TPS

基因的上調表達，進而增加單萜類揮發性化合物的產量。王紅的研究表明LoMYC2對百合花香物質形成有積極的作用。8個百合啟動子順式作用元件的分析表明，激素響應類別中響應MeJA的作用元件占比最多，預示著百合

LhTPS

可能受MeJA誘導。近起始密碼子端亞洲百合CGTCA-motif和MYC作用元件中的序列與其它百合啟動子中的序列不一致，這也許與亞洲百合無香的表型相關。G-box、CGTCA-motif和MYC是否是后續研究的重點，尚需通過啟動子瞬時表達及基因短截試驗進行驗證。

4 結 論

本研究首次克隆到8個百合品種的

TPS

啟動子序列，發現品種間的啟動子序列存在豐富的多態性，并可用于百合系統分類研究。雖然本研究分析了啟動子順式作用元件，并基于分析結果和前人的研究推測MeJA順式作用元件可能是

TPS

基因受到轉錄調控的關鍵元件，但并沒有進行實驗驗證，后續需構建瞬時表達載體，檢測啟動子對相關信號通路的響應情況，為理解萜烯合成的調控機制提供較為直接的實驗證據。