牦牛卵泡發育過程中卵丘卵母細胞復合體的轉錄組分析

何向東 字向東 夏 憶 陳 瑩

(西南民族大學 動物科學國家民委重點實驗室，成都 610041)

雌性動物在出生前后，卵巢上形成大量由卵母細胞和周圍包裹一層扁平狀的顆粒細胞前體細胞構成的原始卵泡。到初情期以后，這些原始卵泡會分期分批有規律地發育依次形成初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。隨著卵泡的發育，顆粒細胞不斷增殖，當發育到次級卵泡后開始出現膜細胞的發育，三級卵泡以后現顆粒細胞之間的分離，形成許多不規則的腔隙，充滿卵泡液，各個小腔隙逐漸合并形成卵泡腔，進入有腔卵泡發育階段。隨著卵泡液增多，卵泡腔也逐漸擴大，卵母細胞被擠向一邊，并被包裹在一團顆粒細胞中，該結構即為卵丘卵母細胞復合體(Cumulus oocyte complexes, COCs)。COCs中卵丘細胞與卵母細胞的互作對卵泡發育和卵母細胞成熟起至關重要的作用。絕大多數卵泡在不同發育階段閉鎖，只有極少數發育到最后成熟排卵。遺傳、營養和內分泌等一系列因素作用于下丘腦-垂體-性腺軸，直接或間接調節COCs中一系列基因和蛋白按特定的時空順序表達決定卵泡發育的命運。

牦牛(

Bos

grunniens

)是分布在海拔2 500～5 000 m 的青藏高原及其毗鄰高山、亞高山地區的重要牛種。目前，全世界有約1 500余萬頭牦牛，其中，我國的牦牛數量占世界95%以上。牦牛是我國青藏高原人民賴以生存的生產和生活資料，對高寒低氧的生態環境的獨特適應能力決定了該畜種在青藏高原畜牧業中占據不可替代的特殊地位。但是，牦牛是季節性繁殖的單胎動物，其繁殖季節主要集中在每年的7～9月份，繁殖率低(40%～60%)，因此,探明牦牛卵泡發育調控機制對提高牦牛繁殖力具有重要意義。自2012 年牦牛全基因組序列測定發布后，以基因組學、轉錄組學為代表的“組學”相關技術和方法逐步被應用到牦牛科學上，有關牦牛基因組和轉錄組研究的成果相繼涌現，并取得了諸多突破性的研究成果。據報道，牦牛體外成熟卵母細胞與未成熟卵母細胞有4 767個差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)，凋亡通路、內吞通路及代謝通路是上調的關鍵調控通路, 而代謝通路、丙酮酸代謝、黏著斑及氧化磷酸化是下調的關鍵調控通路。母牦牛的卵巢在冷季(非繁殖季節)和暖季(繁殖季節)存在320個DEGs，主要包括

FST

、

CYP1A1

、

PIK3R1

和

PIK3R2

等與雌激素的分泌與代謝信號通路相關的基因。牦牛的這些基因組和轉錄組在卵泡發育機制的相關研究主要集中在對整個卵巢或卵母細胞的研究。但是，有關牦牛COCs發育轉錄組學尚未見報道，因此，本研究旨在探討牦牛有腔卵泡發育過程中COCs轉錄組變化，為解析牦牛卵泡發育與成熟調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品收集及RNA提取

2019年11月，在四川省成都市青白江區屠宰場采集牦牛卵巢，母牦牛均為健康未孕。目前，用于體外受精(

In

vitro

fertilization, IVF)的牦牛與普通牛COCs通常都是在卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡中收集，而在普通牛的研究表明，直徑2～3 mm與6～8 mm的卵泡中獲得的COCs的發育能力有顯著差異，因此，本研究將直徑2～3 mm、4～5 mm和6～8 mm的牦牛卵泡分別確定為小卵泡、中卵泡和大卵泡。用帶18針頭的注射器從卵泡中分別抽取COCs，每種卵泡中收集20枚COCs，采用Trizol試劑(Invitrogen, 美國)提取總RNA用于構建測序文庫。

1.2 RNA-seq 文庫構建

RNA的質量和含量通過使用NanoDrop 2000分析儀(Thermo,美國)檢測吸光度260 nm/280 nm比值進行測定, 完整性通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,美國)進行檢測。每種卵子取1 μg質量合格的RNA混合樣，按NEBNextUItraRNA Library Prep Kit for Illumina(NEB,美國)建庫試劑盒的說明書進行建庫。

主要包括以下步驟：利用Oligo(dT)磁珠富集每種卵子帶有polyA尾的mRNA，加入NEB片段化緩沖液(5×)將mRNA隨機打斷成短片段。以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成第一鏈cDNA。隨后用DNA polymerase I和RNase H合成第二鏈cDNA。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭后，用AMPure XP beads(Beckman Coulter, 美國)篩選大小在250～300 bp的cDNA片段進行PCR擴增，然后再次使用AaMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得雙末端(Paired-end, PE)測序文庫。文庫經Qubit 2.0熒光定量儀(Life Technologies，美國)和Agilen1 2100生物分析儀質檢合格后在 Illumina cBot 上進行簇的生成，最后用 Illumina HiSeq2500 進行雙末端測序(天津諾禾致源科技有限公司)。

1.3 序列分析

測序得到的原始數據首先用SOAPnuke(https:∥github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke, v1.5.2)進行過濾得到clean reads用于后續分析。采用HiSat軟件(http:∥www.ccb.jhu.edu/software/hisat, v2.0.4)將過濾后的數據比對到牦牛參考基因組(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=yak)。用RSEM(http:∥deweylab. biostat.wisc.edu/ RSEM, v1.2.12)計算基因表達水平。

1.4 數據分析

使用edgeR(v3.28.0)軟件進行差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)檢測，以|logFold Change|>1且

P

<0.05為篩選標準篩選DEGs。將獲得的DEGs向GO數據庫(http:∥www.geneontology.org/)各個條目進行映射，計算其數目，用Benjamini 法對

P

值進行校正后，Q<0.05的GO條目即為在DEGs中顯著富集的GO條目。通過與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)數據庫(http:∥wego.genomics.org.cn)進行比對，對基因涉及的信號通路或代謝途徑進行分析。

2 結果與分析

2.1 測序質量評估及基本數據分析

利用Agilent High Sensitivity DNA Kit試劑盒經Agilent 2100生物分析儀檢測，構建的牦牛小卵泡COCs、中卵泡COCs和大卵泡COCs 3個測序文庫樣本峰圖顯示在1～2 kb片段長度范圍存在明顯的目的產物主峰，有部分1 kb以下小片段產物但比例較小，表明原始樣本完整性較好，判定合格，符合建庫要求。3個樣本Q30百分比分別為 93.70%、93.52%和93.68%，說明測序質量和文庫構建質量高，測序數據準確可靠，可滿足后續分析。對小、中和大卵泡COCs的轉錄組測序分析，堿基含量分布圖顯示堿基質量穩定于30%～40%，堿基質量分布圖顯示A-T、C-G含量均大體對應重合，說明堿基構成穩定且平衡。說明本次轉錄組測序質量高，符合轉錄組數據研究要求。

2.2 測序結果比對分析

對HiSeq2500測序所得的原始測序序列進行數據過濾后，得到小卵泡、中卵泡和大卵泡 3個發育階段的牦牛COCs干凈數據序列數(Clean reads)為32 905 166～47 542 818條。采用HiSat軟件將獲得的Clean reads與參考基因組進行比對分析。結果表明，每個階段有94.62%～95.51% Clean reads唯一比對(Unique-mapped)上牦牛參考基因，比對到基因組多個位置的序列比例(Multi-map rate)為2.16%～2.22%，符合要求(表1)。

表1 牦牛卵丘卵母細胞復合體轉錄組測序數據與參考基因組比對分析
Table 1 Comparative analysis of transcriptome of yak COCs and mapping to the reference genome

指標Index小卵泡COCsSmall COCs中卵泡COCsMedium COCs大卵泡COCsLarge COCs原始序列數 Raw reads47 629 88432 982 61644 094 580干凈數據序列數 Clean reads43 998 576 (99.78)32 905 166 (99.78)47 542 818 (99.82)唯一比對到基因組的序列數 Unique-mapped42 023 040(95.51)31 250 036(94.97)44 985 014(94.62)比對到基因組多位點的序列數 Multi-mapped reads1 020 767(2.32)710 752(2.16)1 055 451(2.22)未比對到基因組的序列數 Unmapped reads954 769(2.17)944 378(2.87)1 502 353(3.16)

注：括號內的數字表示占原始序列數的百分比。

Note: Data in the brackets represent percentage to raw reads.

2.3 卵泡發育過程中COCs基因表達特征及差異表達基因分析

在小、中、大卵泡3個階段的COCs中共檢測到17 342個基因表達，其中有14 660個基因在3個階段共表達，有692、315和399個基因分別在小、中、大COCs中特異表達(圖1)。

S：小卵泡的卵丘卵母細胞復合體；M：中卵泡的卵丘卵母細胞復合體；L：大卵泡的卵丘卵母細胞復合體 S: COCs from small follicles; M: COCs from medium follicles; L: COCs from large follicles圖1 牦牛卵泡發育過程中COCs基因表達韋恩圖Fig.1 Venn diagram of gene expression of COCs during follicle development

采用edgeR軟件進行DEGs檢測的結果顯示，小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，其中，S100鈣結合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,

S100A9

)、可溶性載體族25(Solute carrier family 25 member 47,

SLC25A47

)和胞外基質磷酸糖蛋白(Matrix extracellular phosphoglycoprotein,

MEPE

)等435個基因上調，胞質tRNA2-硫代化蛋白(Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1,

TUC1/NCS6

)、非典型趨化因子受體3(Atypical chemokine receptor 3,

ACKR3

)和谷氨酸受體代謝型1(Glutamate receptor, metabotropic 1,

GRM1

)等444個基因下調。中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs，其中，神經肽B (Neuropeptide B,

NPB

)、絲氨酸/精氨酸相關核基質蛋白2(Serine/arginine repetitive matrix protein 2-like,

SRRM2

)和胞質tRNA2-硫代化蛋白1(Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1,

TUC1/NCS6

)等590個基因上調，錨蛋白重復結構域蛋白1(Ankyrin repeat domain 1,

ANKRD1

)、同源異形盒D10(Homeobox D10,

HOXD10

)和去整合素金屬蛋白酶1(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1,

ADAMTS1

)等970個基因下調(圖2(a))。兩個發育階段有423個DEGs相同，中卵泡發育到大卵泡COCs的特異DEGs數(1 137個)高于小卵泡發育到中卵泡COCs的特異DEGs數(456)(圖2(b))。牦牛小卵泡到中卵泡發育過程中COCs的前10位上調基因包括和下調基因及從中卵泡發育到大卵泡前10位上調基因和下調基因分別見表2和3，2個階段的前10位上調基因和下調基因存在明顯差異。

S:小卵泡COCs；M:中卵泡COCs；L:大卵泡COCs。 S: COCs from small follicles; M: COCs from medium follicles; L: COCs from large follicles.圖2 牦牛COCs差異表達基因分析Fig.2 DEG analysis of yak COCs

表2 牦牛小卵泡與中卵泡卵丘卵母細胞復合體的前10位上調基因和下調基因
Table 2 Top 10 up- and down-regulated DEGs between yak COCs from small and medium follicles

基因Gene登錄號Gene IDlog2倍比log2 FCP值P value基因描述Description上調基因 Up-regulated genes S100A9BmuPB0184597.664 40.000 1S100鈣結合蛋白A9 S100 calcium binding protein A9 SLC25A47BmuPB0019597.344 20.000 4可溶性載體族25 Solute carrier family 25 member 47 MEPEBmuPB0205947.344 20.000 4胞外基質磷酸糖蛋白Matrix extracellular phosphoglycoprotein HCRTBmuPB0070587.344 20.000 4下丘泌素神經肽前體Hypocretin neuropeptide precursor AGXT2BmuPB0069427.344 20.000 4丙氨酸乙醛酸氨基轉移酶2Alanine-glyoxylate aminotransferase 2 SLC23A1BmuPB0064007.152 90.000 7可溶性載體族23 Solute carrier family 23 member 1 ANKRD62BmuPB0191967.152 90.000 7錨蛋白重復結構域蛋白Ankyrin repeat domain-containing protein 62-like DIRAS3BmuPB0121377.152 90.000 7DIRAS家族 GTP酶3 DIRAS family GTPase 3 MOXD2BmuPB0217987.152 90.000 7DBH 樣單加氧酶蛋白2Putative DBH-like monooxygenase protein 2 IFNB2BmuPB0143727.152 90.000 7干擾素β-2 Interferon beta-2下調基因 Down-regulated genes TUC1/NCS6BmuPB021329-8.564 88.76×10-7胞質tRNA2-硫代化蛋白Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1 ACKR3BmuPB017683-8.513 41.22×10-6非典型趨化因子受體3 Atypical chemokine receptor 3 GRM1BmuPB007411-8.317 62.94×10-6谷氨酸受體代謝型1 Glutamate receptor, metabotropic 1 ANO2BmuPB013453-8.125 67.72×10-6阿諾菌胺-2 Anoctamin-2 BNIPLBmuPB019114-7.779 14.53×10-5BCL2樣相互作用蛋白質 BCL2 interacting protein like DSG2BmuPB002343-7.642 27.45×10-5橋粒芯糖蛋白2 Desmoglein 2 LRRC38BmuPB006751-7.491 00.000 2富含亮氨酸重復蛋白38 Leucine rich repeat containing 38 LDHDBmuPB001552-7.322 10.000 3乳酸脫氫酶D Lactate dehydrogenase D TRIM68BmuPB015987-7.261 10.000 4三結構域蛋白家族 Tripartite motif containing 68 TTFBmuPB012707-7.197 40.000 5T轉錄因子T brachyury transcription factor

注：logFC倍比表示log中卵泡COCs基因表達量/小卵泡COCs基因表達量。

Note: logFC represents log gene expression of medium COCs to small COCs.

2.4 差異表達基因的GO富集分析.

經GO注釋分類分析后發現，牦牛小卵泡與中卵泡COCs之間的DEGs注釋到106條GO條目(GO term)上，其中生物過程(Biological process, BP)類別(Category)46條，細胞組成(Cellular component, CC)類別25條，分子功能(Molecular function, MF)類別35條。在BP分類中，信號傳導(Signal transduction)、運輸(Transport)和生物過程(Biological process)等GO條目最為顯著富集；在CC分類中，細胞組分(Cellular component)、蛋白質復合物(Protein complex)和細胞膜(Plasma membrane)等GO 條目最為顯著富集；在MF分類中，結構分子活性(Structural molecule activity)、酶調節劑活性(Enzyme regulator activity)和脂質結合(Lipid binding)等GO 條目最為顯著富集。每個分類中前20條GO條目見圖3。

表3 牦牛中卵泡與大卵泡卵丘卵母細胞復合體的前10位上調基因和下調基因
Table 3 Top 10 up- and down-regulated DEGs between yak COCs from medium and large follicles

基因Gene登錄號Gene IDlog2倍比log2FCP值P value基因描述Description上調基因 Up-regulated genes NPBBmuPB0119479.188 62.87×10-8神經肽B Neuropeptide B SRRM2BmuPB0212578.817 32.23×10-7絲氨酸/精氨酸相關核基質蛋白2Serine/arginine repetitive matrix protein 2-like TUC1/NCS6BmuPB0213298.637 26.35×10-7胞質tRNA2-硫代化蛋白1Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1 SEZ6LBmuPB0162168.374 92.45×10-6癲癇樣相關蛋白6 Seizure related 6 homolog like TRIM68BmuPB0159878.316 23.54×10-6三結構域蛋白家族 Tripartite motif containing 68 MGAM2BmuPB0217968.223 35.19×10-6麥芽糖化酶 Probable maltase-glucoamylase 2 HIST2H3BE-LBmuPB0148268.089 59.48×10-6組蛋白H2BHistone H2B type 3-B-like RHOXF1LBmuPB0193097.980 31.80×10-5Rhox同源框家族成員1樣Rhox homeobox family member 1-like LRRIQ4BmuPB0110547.820 53.57×10-5富含亮氨酸重復蛋白Q4Leucine rich repeats and IQ motif containing 4 SPERTBmuPB0025867.777 64.53×10-5精細胞相關蛋白 Spermatid associated下調基因 Down-regulated genes ANKRD1BmuPB006185-9.661 22.07×10-9錨蛋白重復結構域蛋白1 Ankyrin repeat domain 1 HOXD10BmuPB017774-9.040 78.64×10-8同源異形盒D10 Homeobox D10 ADAMTS1BmuPB015735-8.342 03.54×10-6去整合素金屬蛋白酶1ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1 NR4A2BmuPB000369-8.249 26.32×10-6細胞核受體第4亞科A組成員2Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 S100A12BmuPB018458-8.200 47.72×10-6鈣結合蛋白S100A12S100 calcium binding protein A12 KIAA1257BmuPB019629-8.200 47.72×10-6KIAA1257同源基因 KIAA1257 ortholog SGK1BmuPB007356-8.150 09.48×10-6人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Sgk1Serine/threonine-protein kinase Sgk1 ZNF333BmuPB010215-8.097 71.17×10-5鋅指蛋白333 Zinc finger protein 333 TSPYL1BmuPB020407-7.987 12.25×10-5睪丸特異編碼蛋白1Testis-specific Y-encoded protein 1-like RRHBmuPB008986-7.928 42.82×10-5視網膜色素上皮衍生的視紫紅質同系物Retinal pigment epithelium-derived rhodopsin homolog

注：logFC倍比表示log大卵泡COCs基因表達量/中卵泡COCs基因表達量。

Note: logFC represents log gene expression of large COCs to medium COCs.

圖3 小卵泡與中卵泡卵丘卵母細胞復合體的差異表達基因GO分類注釋圖Fig.3 Gene ontology classification of DEGs between COCs from small and medium follicles

牦牛中卵泡與大卵泡COCs之間的DEGs注釋到114條GO條目上，其中BP 55條、CC 26條和MF 33條。不同發育階段不僅GO條目上富集的基因數量和二級條目的數量不同，而且二級條目的排列順序有一定的差異。例如，從小卵泡發育到中卵泡的過程中BP類別中基因富集排列第2和第3的GO條目分別是運輸和生物過程，而在中卵泡發育到大卵泡的排列順序正好相反。在BP類別的前20條GO條目只有第1、4、16、19條在2個發育階段的排列順序完全一致；在CC類別的前20條GO條目只有第1、2、9、10條在2個發育階段的排列順序完全一致；在MF類別的前20條GO條目只有第1、2、3、4、5、12條在2個發育階段的排列順序完全一致(圖4)。

圖4 中卵泡與大卵泡卵丘卵母細胞復合體的差異表達基因GO分類注釋圖Fig.4 Gene ontology classification of DEGs between COCs from medium and large follicles

2.5 差異基因KEGG通路分析

牦牛卵泡發育過程中COCs差異表達基因KEGG分析表明，小卵泡與中卵泡COCs的DEGs富集在254條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)和細胞粘附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)等重要通路。中卵泡與大卵泡COCs的DEGs富集在276條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)和cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等重要通路。2個發育階段

P

<0.05且DEGs富集程度最高的前20條通路見圖5。

圖5 牦牛卵泡發育過程中COCs差異表達基因KEGG富集分析散點圖Fig.5 Scatter diagram of KEGG enrichment analysis for DEGs of yak COCs during follicle development

3 討 論

文庫構建和測序質量評估結果顯示，本研究文庫構建質量和測序質量高，測序數據準確可靠。雖然中卵泡COCs的Clean reads比較低，但在不同組織中的轉錄組學研究表明，大于 6×10條reads的測序文庫就能夠檢測到組織中大部分表達的基因。因此,認為中卵泡32 905 166條Clean reads的測序深度是足夠的，能夠客觀反映牦牛卵泡發育過程中COCs的基因表達情況。由于本研究用的牦牛COC的RNA量少，不能滿足進一步開展q-PCR驗證的需求，因此，本研究對測序結果未作進一步的qRT-PCR驗證。

本研究通過對基因表達分析，發現小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，其中，435個基因上調，444個基因下調；中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs，其中，590個基因上調，970個基因下調。2個階段DEGs中，尤其是中卵泡發育到大卵泡過程中，COCs下調基因數量高于上調基因數量，說明卵巢中COCs的發育能力整體上是逐漸減弱，這與前人關于卵泡發育動態的研究結果一致，即在發情周期的每一個卵泡波中都有幾個到幾十個卵泡發育，但大多數卵泡在發育的不同階段閉鎖退化，最終只有少數卵泡能發育到最后成熟排卵。相對于未成熟卵母細胞而言，體外成熟的牦牛卵母細胞中下調基因的數量(3 343個)也是高于上調基因(1 418個)的數量，這些研究結果提示，在卵泡發育進程中COCs表達量下調基因數目增加，可能與多數卵泡和卵母細胞發育與成熟能力逐漸減弱、趨向閉鎖之間有一定關聯性。下丘腦促性腺素釋放激素(GnRH)調節腦垂體促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的合成與釋放，FSH和LH對調節有腔卵泡的發育與成熟起至關重要的作用。卵巢的卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵丘細胞和卵母細胞中一系列基因和蛋白按特定的時空順序表達以及卵丘細胞與卵母細胞分泌因子的互作，最終決定卵泡發育的命運是成熟排卵還是在發育的不同階段閉鎖。目前發現的參與形成卵母細胞/顆粒細胞調控環的最重要因子包括GDF-9、BMP-15和KITL等。卵母細胞分泌的GDF-9和BMP-15調節卵丘細胞的分裂和KITL的表達，而卵丘細胞分泌的KITL反過來調節卵母細胞的發育與成熟。但是，本研究發現在牦牛卵泡發育過程中，COCs中差異表達基因排名靠前的不是這些基因，說明這些基因在牦牛卵泡發育的不同階段可能都發揮重要作用，但不是階段性特異調控基因。

本研究從基因的差異表達及功能分析發現一些在以前的研究中沒有關注到的可能與卵泡發育相關的一些階段性特異調控基因，例如，

S100A9

、

SLC25A47

、

MEPE

、

TUC1/NCS6

、

GRM1

、

NPB

和

HOXD10

等一些在卵泡發育不同階段差異倍數大的基因。100A9可以提高

Bcl

-2的表達，抑制細胞凋亡；SLC25A47是一種跨膜蛋白，能調節糖、氨基酸、核苷酸、無機離子等物質的跨膜轉運，維持細胞正常功能；MEPE保護細胞DNA損傷，對細胞具有保護作用。TUC1/NCS6是硫代tRNA細胞庫的維持和細胞生長必需的物質；GRM1抑制細胞生長。NPB與卵巢中孕酮和雌二醇的分泌相關；HOXD10抑制細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。因此，這些基因在牦牛不同大小卵泡中表達量的差異可能與牦牛卵泡發育與卵母細胞的成熟有關。本研究采用Illumina平臺對COCs進行測序，樣本是卵母細胞和卵丘細胞的混合物，雖然結果能反映出牦牛卵泡發育過程中轉錄組的全局性變化，但獲得的數據在一定程度上與卵丘細胞占的比例有關系，因此，為了進一步探明卵母細胞和卵丘細胞在卵泡發育中的分子調控機制，有必要進一步開展卵泡在同一個發育階段的這兩種細胞單獨測序分析。在牦牛卵泡發育的2個階段，DEGs種類和數量不同，GO富集條目和KEGG富集也不同，提示在不同大小的卵泡中收集的COCs的體外成熟(

In

vitro

maturation, IVM)要求條件不一樣。目前，在牦牛和普通牛的卵母細胞IVM中，從直徑2～8 mm大小不等的卵泡中收集的COCs都是在相同的IVM液中共同培養。比利時、丹麥和法國等國的研究表明，在相同體外受精(IVF)系統里，牛小卵泡、中卵泡和大卵泡獲得的卵母細胞的卵裂率和囊胚率有顯著差異。因此，如果根據卵泡大小的發育特點調整IVM液的成分，對COCs進行分類培養則有望提高牦牛卵母細胞的成熟率和發育能力。

本研究KEGG分析發現，DEGs富集程度高的神經活性配體-受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞粘附分子、鈣離子信號等通路是牦牛COCs發育的關鍵調控通路。在其他物種的研究證明，這些通路在卵泡的發育中發揮重要調控作用。牛屬及其他物種卵母細胞發育轉錄組相關研究表明，MAPK、Wnt及P13K/Akt凋亡通路在卵母細胞成熟中起了關鍵調控作用。TGF-β信號通路、雌激素信號通路、VEGF信號通路、丙酮酸代謝、ErbB信號通路等都參與卵泡發育調控，本研究發現這些通路在牦牛卵泡發育過程中也發生富集，說明這些通路在牦牛卵泡發育中也發揮重要調控作用。本研究還發現DEGs在血小板活化(Platelet activation)通路富集程度高，與在牦牛卵母細胞IVM液中添加適當濃度的血小板活化因子(PAF)可以提高牦牛卵母細胞成熟率的研究結果相吻合。

4 結 論

本研究運用轉錄組學系統分析了牦牛不同大小的有腔卵泡發育過程中COC轉錄組差異，篩選得到小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs。這些DEGs主要富集在神經活性配體-受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞黏附分子、鈣離子信號通路和cAMP信號通路等重要通路，為揭示牦牛卵泡發育與成熟調控機制及完善牦牛卵母細胞體外成熟技術提供了理論依據。