食品中大腸菌群能力驗證結果分析

種 婷

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽 110032）

大腸菌群是一群革蘭氏陰性無芽孢桿菌，能發酵乳糖，產酸產氣，一般用來作為食品是否受到糞便污染的衛生指示菌[1]。糞便中可能含有腸道致病菌，如沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特氏菌等，食用受到糞便污染的食品具有潛在危害，所以大腸菌群檢測在食品微生物檢驗中具有重要意義[2]。

能力驗證是利用實驗室間比對，來評價實驗室檢測能力的一種重要方式[3]。本實驗室報名參加遼寧省市場監督管理局組織的食品中大腸菌數計數能力驗證，按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）檢驗，2名檢驗員對同一質控樣品進行檢驗。通過參加能力驗證，提高本實驗室檢測人員的技術水平，加強實驗室質量控制，確保出具的檢測結果準確可靠。

1 材料與方法

1.1 樣品

遼寧省市場監督管理局發放的編碼為W033質控樣。在生物安全柜內將含有大腸菌群的西林瓶打開，加入少量（2～4 mL）無菌生理鹽水進行溶解，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的無菌生理鹽水清洗西林瓶內壁，回收無菌生理鹽水，并放入上述無菌瓶中，稀釋液合計40 mL，此溶液即為待測樣品。吸取待測樣品25 mL加入225 mL無菌生理鹽水中，充分溶解，均質混勻。

1.2 儀器與試劑

KB240型電熱恒溫培養箱（德國Binder公司）；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；CX31型顯微鏡（日本Olympus公司）；KG-SX-700高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogoy公司）；均質器（法國梅里埃公司）；MICROFLEX LT/SH基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（德國布魯克公司）。

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Agar，VRBA）、煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）、肉湯（美國BD公司）；伊紅美藍瓊脂（Eosin-Methylene Blue Agar）、革蘭氏染色液試劑盒（北京陸橋技術股份有限公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）（德國Bruker公司）。

1.3 試驗方法

依據作業指導書以及《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）第二法大腸菌群平板計數法，2名檢驗員同時進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 可疑菌落計數

VRBA平板上有3種菌落形態，各不同菌落形態見表1。不同菌落形態的菌落數見表2。

表1 VRBA平板上菌落形態

表2 VRBA平板不同形態菌落計數

2.2 確證試驗

選取1∶10和1∶100稀釋度VRBA平板上各10個不同類型典型和可疑菌落，接種至BGLB肉湯管中，36 ℃培養24～48 h，觀察產氣情況，結果見圖1，凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性（+），結果見表3。為了確保結果準確可靠，將典型菌落和可疑菌落分別接種至EMB平板，同時革蘭氏染色鏡檢觀察，結果分別見圖2和圖3。

圖1 典型菌落和可疑菌落在BGLB肉湯中生長情況

表3 確證試驗BGLB肉湯結果

圖3 革蘭氏染色鏡檢結果

2.3 樣品結果報告

經證實，大腸菌群陽性的試管比例乘以相應稀釋度VRBA平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每mL樣品中大腸菌群結果，因此樣品W033結果報告為 3 600 CFU/mL。

3 結論與討論

GB 4789.3—2016標準中第一法MPN計數適用于檢測大腸菌群含量較低的食品；第二法平板計數法適用于檢測大腸菌群含量較高的食品，本次試驗采取平板計數法進行檢驗[4]。平板計數法用結晶紫中性紅膽鹽培養，分2次傾注平板。第1次傾注平板時要有一定的厚度，給細菌提供充足的營養。第2次傾注平板，能防止細菌蔓延生長；降低需氧菌生長速度；截留大腸菌群產生的氣體，觀察產氣 情況。

BGLB發酵管有明顯不同，可疑菌落接種的BGLB肉湯管培養24 h無變化，培養至48 h時，不僅產氣，而且BGLB肉湯變黃。為了確證該菌是否屬于大腸菌群，將產氣不變色和產氣變黃的BGLB肉湯均劃線接種至EMB平板，36 ℃培養24 h，產氣不變色的BGLB肉湯劃線接種在EMB平板上生長的菌落具有大腸桿菌的典型特征，紫黑色菌落，帶有綠色金屬光澤。產氣變黃的BGLB肉湯劃線接種在EMB平板上生長的菌落呈現淡粉色，表面濕潤。經革蘭氏染色鏡檢VRBA平板上生長的3種不同形態的菌均為革蘭氏陰性桿菌。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對3種菌進行快速鑒定，鑒定結果顯示典型菌落1為大腸桿菌（分值2.235），典型菌落2為大腸桿菌（分值2.367），可疑菌落3為克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌，分值2.286）。克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）屬于腸桿菌屬，其特征符合大腸菌群的定義，故其數量應計算在結果中[5]。

參加能力驗證時應注意：①運輸過程中溫度控制是否達標，溫度波動過大，對計數型質控樣菌數有較大影響；②收到樣品后要第一時間冷藏保存，若冷凍保存，易導致結果異常；③樣品在水化前是否使樣品恒溫到室溫，若快速升溫易造成細胞破裂，導致結果出現偏差[6]；④均質時間要適宜，若均質時間過短，冷凍干燥的樣品溶解不充分，其中的菌體團沒有完全分散開，易造成結果偏低；⑤應在 15 min內完成試驗，操作時間過長會導致菌體死亡，導致結果偏低。

經能力驗證組織機構反饋，本實驗室W033大腸菌群的檢測結果|Z|＜2，結果滿意[7]。本次能力采取人員比對來減小操作誤差，以確保檢測結果可靠。2名檢驗員檢測結果基本一致，說明本次能力驗證基本無人為誤差。本次能力驗證所用的培養基及試劑均經過《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）驗證，符合試驗要求。通過本次能力驗證，可提高本實驗室大腸菌群檢測能力以及本實驗室的競爭力。