人工種植和野生杜仲葉中主要活性成分含量變化研究

章發盛 黃繼紅 黃靜

(湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000)

杜仲為古老的第三紀孑遺植物，其野生種群被列為國家二級保護植物，是多年生落葉喬木，樹高可達20m以上[1]。但是，喬木自然栽培模式，對于采摘杜仲鮮葉十分困難，所以，當前大多采用果園化栽培方法進行人工種植，以適應杜仲產業高質量發展需求。2005年，我國將杜仲葉正式列入《中華人民共和國藥典》(一部)，為杜仲科植物杜仲的干燥葉。夏、秋兩季枝葉茂盛時采收，曬干或低溫烘干，具有補肝腎、強筋骨功能[2]，并確定綠原酸為杜仲葉藥材的主要藥用有效成分及其含量標準。

湖南是中國杜仲的重要原產地和傳統栽培模式的主產區之一，占全國總數的1/5，湘西武陵山區的杜仲占全省的80%，是湖南杜仲的集中聚集區[3]，近年來湘西龍頭企業從外地引進了杜仲優良品種，采用果園化栽培模式開展杜仲良種示范園建設，促進杜仲產業發展，助推湘西鄉村振興。本實驗采收不同月份湘西山區3家人工種植基地和3處野生杜仲林中鮮葉為樣品，低溫烘干后粉碎，采用高效液相色譜法對杜仲葉中主要活性成分綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、車葉草苷、異槲皮素和蘆丁進行測定。研究人工種植和野生杜仲葉不同生長期6種活性成分積累的變化規律，為湘西武陵山區杜仲葉的合理采收期提供科學依據。

1 試驗方法

1.1 基地基本情況

1.1.1 野生杜仲基地(樹齡約35a)

張家界永定區科三灣；吉首市馬頸坳鎮良章營；花垣縣金龍鎮補毫村。

1.1.2 人工種植基地(外地引種，樹齡約10a)

永順縣芙蓉鎮孔坪村(“華仲1號”)；瀘溪縣潭溪鎮新寨坪(“華仲8號”)；保靖縣遷陵鎮土碧村(“秦仲5號”)。

1.2 杜仲葉的采收和處理

從2021年4月開始搜尋人工種植和野生杜仲栽培基地，確定為研究基地后，間隔1個月依次采收(由于疫情等條件限制，個別基地有少量缺失)，一直到11月落葉前。對采集的鮮葉曬干，60℃低溫烘干，粉碎過篩后，常溫干燥保存。

1.3 人工種植和野生杜仲葉中6種活性成分含量的測定方法

1.3.1 含水率的測定方法

采用直接干燥法[4]測定低溫烘干后的杜仲葉樣品的含水率，以干燥品計算6種活性成分含量。

1.3.2 活性成分的提取條件和測定方法

準確稱取0.5g杜仲葉樣品，用70%乙醇浸提過夜，超聲提取3次，合并濾液，用70%乙醇定容待檢。

采用日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(配置二極管陣列檢測器)同時測定6種活性成分含量。標準品相關信息見表1。

2 結果與分析

2.1 人工種植和野生杜仲葉中綠原酸含量的比較分析

不同月份采集的人工種植和野生杜仲葉中綠原酸含量的測定結果如表2所示。

表1 標準品及其規格與生產廠商

表2 不同月份杜仲葉中綠原酸的含量

由表2可知，4月杜仲始發嫩芽，到11月落葉前，綠原酸含量2.541～52.554mg·g-1，按照《中華人民共和國藥典》2020(一部)，綠原酸含量不得少于0.080%標準[2]，分別是《藥典》規定的3.17～65.69倍。16批次野生杜仲葉綠原酸平均含量21.72mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉綠原酸平均含量32.93mg·g-1，人工種植為野生杜仲葉的1.5倍。從圖1分析，5月開始枝葉茂盛，綠原酸含量28.469～36.27mg·g-1，可以進入采收期，并且含量隨著生長時間的增長逐漸增加。8月綠原酸含量降低，9月上升，10月再次降低，11月再次上升，呈現出W型形態。由綠原酸含量分析，8月、9月和11月為提取綠原酸添加劑產業的鮮葉最佳采收期。

2.2 人工種植和野生杜仲葉中桃葉珊瑚苷含量的比較分析

不同月份采收的人工種植和野生杜仲葉中桃葉珊瑚苷含量的測定結果如表3所示。

表3 不同月份杜仲葉中桃葉珊瑚苷的含量

由表3可知，16批次野生杜仲葉桃葉珊瑚苷平均含量11.16mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉桃葉珊瑚苷平均含量12.37mg·g-1，人工種植和野生杜仲葉的桃葉珊瑚苷含量差異很小。然而，由圖2分析，同一基地桃葉珊瑚苷隨著生長時間的增長起伏很大。4月和6月張家界科三灣野生杜仲葉以及6月保靖土碧村人工種植基地桃葉珊瑚苷積累很少，均沒有檢出。從時間跨度分析，桃葉珊瑚苷含量呈駱駝雙峰變化趨勢，7月為第1個高峰13.55mg·g-1，除吉首良章營野生杜仲外，均超過10mg·g-1，9月為第2個高峰值，桃葉珊瑚苷平均含量33.746mg·g-1，最高值達到55.659mg·g-1，進入提取桃葉珊瑚苷活性物質的最佳采收期。

2.3 人工種植和野生杜仲葉中京尼平苷酸含量的比較分析

不同月份采收的人工種植和野生杜仲葉中京尼平苷酸含量的測定結果如表4所示。

圖1 不同月份人工種植和野生杜仲葉中綠原酸含量趨勢圖 圖2 不同月份人工種植和野生杜仲葉中桃葉珊瑚苷含量趨勢圖

表4 不同月份杜仲葉中京尼平苷酸的含量

由表4可知，16批次野生杜仲葉京尼平苷酸平均含量7.15mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉京尼平苷酸平均含量7.95mg·g-1，人工種植和野生杜仲葉的京尼平苷酸含量差異不大。但是，由圖3分析，同一基地京尼平苷酸隨著生長時間的增長，9月為達到最高平均值21.09mg·g-1(張家界科三灣野杜仲除外)，最高值達到30.947mg·g-1。張家界科三灣野杜仲葉，4月和6月京尼平苷酸含量均未檢出，9月京尼平苷酸含量0.338mg·g-1，10月含量6.566mg·g-1，最高值比其他5個基地推遲了1個月份，可能與張家界杜仲品種以及生長海撥較高相關。

2.4 人工種植和野生杜仲葉中車葉草苷含量的比較分析

不同月份采收的人工種植和野生杜仲葉中車葉草苷含量的測定結果如表5所示。

由表5可知，16批次野生杜仲葉車葉草苷平均含量5.58mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉車葉草苷平均含量7.79mg·g-1，人工種植為野生杜仲葉的車葉草苷含量1.4倍。從圖4分析，車葉草苷的含量隨著生長時間的增長逐漸增加。4月采收的嫩葉中車葉草苷含量很少，3處基地樣品中均未檢出。5月開始穩步增長，車葉草苷平均含量5.06mg·g-1，6月平均含量3.365mg·g-1(除張家界科三灣外)，7月平均含量6.918mg·g-1，8月平均含量降低至5.187mg·g-1，9月上升至平均含量16.00mg·g-1(除張家界科三灣外)，達到全年最高值，10月再次下降至5.53mg·g-1，11月再次上升到10.85mg·g-1，整體趨勢呈現出W型形態。

2.5 人工種植和野生杜仲葉中異槲皮素含量的比較分析

不同月份采收的人工種植和野生杜仲葉中異槲皮素含量的測定結果如表6所示。

圖3 不同月份人工種植和野生杜仲葉中京尼平苷酸含量趨勢圖 圖4 不同月份人工種植和野生杜仲葉中車葉草苷含量趨勢圖

表6 不同月份杜仲葉中異槲皮素的含量

由表6可知，16批次野生杜仲葉異槲皮素平均含量1.51mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉異槲皮素平均含量4.20mg·g-1，人工種植是野生杜仲葉的異槲皮素含量2.8倍。從圖5分析，異槲皮素的含量隨著生長時間穩定增長，異槲皮素的含量范圍0.108～9.829mg·g-1，11月異槲皮素的平均含量達到最高值5.76mg·g-1。

2.6 人工種植和野生杜仲葉中蘆丁含量的比較分析

不同月份采收的人工種植和野生杜仲葉中蘆丁含量的測定結果如表7所示。

表7 不同月份杜仲葉中蘆丁的含量

圖5 不同月份人工種植和野生杜仲葉中異槲皮素含量趨勢圖 圖6 不同月份人工種植和野生杜仲葉中蘆丁含量趨勢圖

由表7可知，16批次野生杜仲葉蘆丁平均含量0.61mg·g-1，19批次人工種植杜仲葉蘆丁平均含量2.05mg·g-1，人工種植是野生杜仲葉的蘆丁含量3.4倍。從圖6分析，蘆丁的含量隨著生長時間的穩定增長，蘆丁的含量范圍0.138～3.444mg·g-1。

3 結論

人工種植和野生杜仲葉中綠原酸含量為2.541～52.554mg·g-1，分別為《中華人民共和國藥典》(一部)標準值0.08%的3.17～65.69倍，遠超規定要求。

人工種植杜仲葉中綠原酸、車葉草苷、異槲皮素、蘆丁的平均含量分別為32.93mg·g-1、7.79mg·g-1、4.20mg·g-1、2.05mg·g-1，分別是野生杜仲葉的1.5倍、1.4倍、2.8倍、3.4倍。人工種植和野生杜仲葉中桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸平均含量差異比較小。說明人工種植和野生杜仲葉中活性成分密切相關，引進優良品種，采用果園化栽培方法人工種植，方便采集杜仲原料，使多數活性成分含量得到提升，具有推廣應用價值，有利于杜仲產業高質量發展。

從杜仲生長周期分析，杜仲葉中綠原酸和車葉草苷含量呈W形趨勢變化，8月、9月、11月為鮮葉最佳采收期。桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸含量為駱駝雙峰形態，7月、9月為鮮葉最佳采收期。異槲皮素和蘆丁含量比較穩定，可以作為主要活性成分的參考。