二乙基亞硝胺誘導斑馬魚肝癌模型的探索與優化

胡 光，李 丹，陳 陽，張云羅，肖袁媛，楊世洲，周 倩

(重慶理工大學 藥物化學與分子藥理學重慶市重點實驗室，重慶 400054)

0 引言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，為臨床常見惡性腫瘤。肝癌是全球癌癥相關死亡的首要原因，在我國的腫瘤死亡原因中僅次于肺癌。根據國際癌癥研究機構(IARC)發布的全球癌癥發病率和死亡率2018 年評估報告顯示，2018 年肝癌成為全球第六大最常見的癌癥以及第四大癌癥死亡的原因，2018 年新增肝癌病例大約為84.1 萬例，新增肝癌死亡患者數量高達約78.2 萬;同時，在全球大多數地區，男性的肝癌患病率與死亡率相對更高，因此，肝癌在全球癌癥病例中排名第五，更在男性死亡數中排名并列第二［1］。根據國家癌癥中心腫瘤登記辦公室統計的2015 年中國癌癥數據，2015 年新發肝癌患者37.0萬，肝癌患者死亡數32.6 萬，在我國主要惡性腫瘤發病數目和死亡原因中，肝癌分別排在第4 位和第2 位［2］。因此，對肝癌進行更深入的機理研究，以對疾病進行治療已刻不容緩。

斑馬魚作為繼大鼠、小鼠后的世界第三大模式動物，其基因測序已基本完成，正被廣泛地應用于各種體內實驗的研究。斑馬魚的基因與人類同源性為87%，在遺傳水平上與人類有高度相似性;此外，斑馬魚作為一種有脊椎骨的動物，在其消化系統(肝腸組織)和心血管系統等部分的生長發育的機制和人體非常相似［3］，因此以斑馬魚為基礎建立的疾病模型也能在一定程度上反應人類疾病的相應情況［4］。斑馬魚作為新型的整體實驗動物模型，具有體外受精、發育迅速、繁殖能力強，以及適合于實驗室飼養等特點;與傳統的細胞、大鼠、小鼠模型相比，斑馬魚還兼有體內、體外2 種模型的優點:胚胎及幼魚期體積很小、魚體透明，可以在光學顯微鏡下進行實時檢測觀察內部器官、組織的變化;成年以后繁殖速度快，短期內能為實驗提供大量的樣本;給藥方式簡單、周期短、成本低，適于大規模藥物的高通量篩選等。

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一種常見的癌癥誘導劑，其經過DNA 上的微端粒體在體內轉化后，可導致諸如核酸、蛋白質等類型的大分子物質被甲基化修飾，從而引起肝細胞損傷甚至壞死;還可以通過刺激肝臟細胞的細胞外基質的合成和分泌的方式，促進肝纖維化的發生與發展，進而促進肝臟腫瘤的形成［5］。除此之外，DEN 水溶性較好且物理化學性質較穩定，適合使用直接浸泡的方式對斑馬魚進行暴露處理［6］，這些因素都使得在斑馬魚身上建立肝癌模型的實驗目的變得更加的簡單、可行。

近年來，斑馬魚在肝臟疾病研究中的應用日益增多:2006 年，Mizgireuv 等［7-8］第一次使用DEN成功誘導了斑馬魚形成肝臟腫瘤;隨后，Fujisawa等［9］也選用DEN 誘導并成功構建斑馬魚肝臟腫瘤模型。2008 年，Rekha［10］首次在HCV 轉基因斑馬魚體內采用硫代乙酰胺誘導出了肝硬化和肝癌。2011 年，Nguyen 等［11］首次利用米非司酮誘導krasV12 轉基因斑馬魚使其發生肝臟腫瘤。到了2012 年，可以在肝臟內特異表達HBX 和HCV 核心蛋白的轉基因斑馬魚被Liu 等成功構建，在該模型上可以明顯地觀察到肝纖維化與膽管細胞癌［12］。

綜上所述，采用DEN 誘導斑馬魚肝癌的實驗模型建立是可行的，本課題組將通過縮短肝癌發生模型的試驗周期、增加肝癌發生的評價方法、完善該模型的評價指標等方式，優化、完善DEN 誘導斑馬魚肝癌的實驗方法，建立更加符合高通量篩選的肝癌評價平臺，為簡單、快速的藥物篩選提供研究基礎和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 月齡AB 品系野生型斑馬魚(上海費曦生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗室主要試劑及儀器

斑馬魚養殖系統(南京一樹梨花生物科技有限公司)，二甲苯(川東化工)，DEN(阿達瑪斯)，中性樹膠試劑(麥克林)，98%3-乙氧?；桨芳谆撬?阿拉丁)，4%多聚甲醛(白鯊生物)，光學顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚的飼養條件

斑馬魚在25～28 ℃環境中飼養，采用時間自動控制裝置保證每日14 h 光照和10 h 黑暗的循環。

1.2.2 斑馬魚成魚DEN 處理濃度篩選

初篩采用的誘導劑DEN 的濃度為0、100、150、200 μg/mL，將8 月齡斑馬魚隨機分組，以20條/組分別在不同的魚缸中喂養。實驗組暴露于相應梯度濃度的DEN 溶液中，對照組暴露于等量的RO 水中，置于同一環境下飼養，持續觀察斑馬魚的生存情況。

1.2.3 肝腸指數檢測

肝腸指數的定義為:斑馬魚肝腸濕重量與斑馬魚整體濕重量的比值。將斑馬魚浸入98%的3-乙氧?；桨芳谆撬嶂新樽?，隨即用天平稱取斑馬魚的整體濕重量，而后在顯微鏡下將斑馬魚的肝腸組織分離開，再用天平稱量肝腸組織的濕重量，同時進行數據記錄，以評價DEN 處理組和對照組斑馬魚在造模期間肝腸臟形態學改變情況。

1.2.4 肝臟石蠟切片的制作

將斑馬魚肝臟用4%的多聚甲醛固定24 h，用PBS 沖洗2～3 次，每次2～3 min。而后，依次采用梯度酒精、二甲苯、65 ℃石蠟2 次浸泡肝臟組織，制備的石蠟標本用石蠟切片機切取5 μm/片的石蠟切片。

1.2.5 HE 染色

石蠟切片以后，將切片用新鮮二甲苯2 次侵泡5 min 脫蠟處理;再用100%乙醇5 min、95%乙醇2 min、80%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸餾水2 min 進行水化處理;用蘇木素浸染35 s，分化液30 s，自來水浸泡15 min，伊紅浸染3 min，自來水浸泡2 min;95%乙醇分別2 次沖洗4 s，100%乙醇沖洗4 s，100%乙醇浸泡1 min，新鮮二甲苯2 次浸泡1 min;最后用中性樹脂進行封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 血管新生評價

對各個濃度的斑馬魚進行解剖，而后對其肝臟組織進行外觀觀察，根據肝臟血管的增生數量以及血管密集程度按照正常、輕度、中度、重度、特重5 個等級評價，并計算各程度的發生率。

2 結果

2.1 誘導劑DEN 濃度的篩選

在濃度篩選過程中，采用50、150、250 μg/mL的DEN 對斑馬魚進行給藥處理。實驗結果顯示，相較于對照組，DEN 濃度為250 μg/mL 時，斑馬魚生存率最低且具有顯著性。在DEN 給藥處理到第4 周時，250 μg/mL DEN 處理組的斑馬魚已全部死亡。在DEN 誘導9 周后，150 μg/mL 實驗組斑馬魚生存率為10%，50 μg/mL 實驗組斑馬魚生存率為70%，因此，篩選出DEN 合適濃度范圍在0～150 μg/mL，選擇150 μg/mL 作為高濃度組、100 μg/mL 作為中濃度組、50 μg/mL 作為低濃度組建模給藥濃度。

圖1 DEN 給藥處理10 周期間斑馬魚生存率變化情況

2.2 DEN 誘導肝癌發生的形態學結果

在造模給藥9 周后對斑馬魚進行觀察記錄。整個實驗過程，對照組斑馬魚存活正常，DEN 處理的各組斑馬魚部分皆出現脊柱彎曲，腹腔膨大現象(圖2);對照組斑馬魚體表干凈，邊緣清晰;DEN處理的各組實驗組斑馬魚體表均出現一定程度的腐爛、黏膩。各組肝臟的形態觀察結果顯示:解剖后，相較于對照組斑馬魚，DEN 處理組斑馬魚腹腔出現腹水，且肝臟明顯膨大，肝臟上有明顯點狀、球狀腫瘤組織出現，膽囊變小且本色綠色變淺;對照組斑馬魚肝臟表面光滑，無結節形成，質地柔軟且呈深紅色，但經DEN 處理后，肝臟結節數量變多且形態大小不一，能夠觀察到較為明顯的腫瘤生長，肝臟出現高度纖維化趨勢，顏色為淡紅色或淡黃色(圖3)。圖3 中，紅圈標注區域為斑馬魚的肝腸組織中有代表性變化的部分。與對照組相比，DEN 處理組肝臟血管密集，表面凹凸不平，進一步證實肝臟腫瘤的形成(圖4)。

圖2 斑馬魚體表觀察實物圖

圖3 斑馬魚肝臟組織表面圖

圖4 斑馬魚肝腸組織血管生成實物圖

2.3 HE 染色結果

從HE 染色的結果(圖5)中可以看出，對照組斑馬魚的肝臟組織結構一切正常，肝細胞排列整齊有序且細胞大小均一(圖5(a));DEN 處理組斑馬魚肝臟組織結構在不同誘導劑濃度下出現不同程度的破壞，細胞排列紊亂且大小不一，出現中性粒細胞浸潤，肝細胞異常分裂，細胞增多，膽管增生，纖維化等現象(圖5(b)-5(d))。

圖5 對照組斑馬魚肝組織HE 染色觀察圖

2.4 肝腸指數檢測結果

由肝腸指數可知，DEN 試劑會引起斑馬魚肝腸大小的變化。由于斑馬魚本身個體小的因素以及斑馬魚的肝臟包裹腸的特點，因此在實驗過程中，將斑馬魚的肝腸同時稱重并記錄。實驗發現，隨著DEN 濃度的增加，肝腸指數有逐步增大的趨勢。經過統計數據進行顯著性差異計算，50 μg/mL 的DEN給藥組與對照組相比無顯著性差異;100 μg/mL和150 μg/mL 的DEN 都能顯著增大斑馬魚的肝腸指數，其中濃度為100 μg/mL 時，P＜0.05，濃度為150 μg/mL 時，P＜0.01。由此說明，DEN 在0～150 μg/mL 的濃度范圍內，能夠呈濃度依賴性地誘導斑馬魚肝腸指數升高。建模后各實驗組斑馬魚肝腸指數直方圖見圖6。與對照組(0 μg/mL)相比，100 μg/mL 和150 μg/mL 的DEN 都能顯著增大斑馬魚的肝腸指數，其中150 μg/mL 時效果更好。圖6中，* 代表P＜0.05，＊＊代表P＜0.01。

圖6 建模后各實驗組斑馬魚肝腸指數直方圖

2.5 肝臟血管新生檢測結果

第10 周后，根據解剖后觀察斑馬魚肝臟的血管新生情況并記錄實驗數據后發現(表1)，對照組斑馬魚肝臟的血管未有增多現象，實驗組斑馬魚肝臟的血管產生了不同程度的血管增生，且血管新生的嚴重程度隨著誘導劑DEN 的濃度增大而加劇。

表1 斑馬魚肝臟血管新生程度 %

3 討論

DEN 作為經典的肝癌造模誘導劑，將斑馬魚長期飼養于含DEN 試劑的溶液中會導致斑馬魚產生肝纖維化，從而發生癌變［13］。Mizgireuv 采用DEN 誘導8 周并清水喂養9 個月(共11 個月)產生腫瘤［7］;Fujisawa 等采用同種藥物誘導2 個月并清水喂養4 個月(共6 個月)成功構建斑馬魚肝臟腫瘤模型［9］。經過查閱大量文獻，發現其他同類斑馬魚肝癌模型的建立時間均較長，本研究將斑馬魚直接浸泡于含DEN 藥物的溶液中，DEN 誘導9 周并清水喂養1～2 周，即可觀察到較為明顯的肝臟腫瘤，并能夠進行相關指標檢測。與現有的研究相比，誘導周期短且效果明顯，極大地縮短了實驗時間，提高了實驗效率，為肝癌藥物的快速篩選提供理論參考。

肝癌的高死亡率迫使人類對其研究不斷深入，以便得到最佳的治療方法，但目前尚無臨床療效肯定的直接抗肝癌的藥物。此外，小鼠類實驗動物的藥物篩選相對繁瑣且費時費力。因此，建立穩定、可靠、經濟的肝癌動物模型具有重要意義。斑馬魚作為模式動物具有高通量的特點，對用藥量需求少，給藥方式簡單且價格便宜。更重要的是，相較于采用肝臟轉基因斑馬魚等模型［14］，實驗使用野生型AB 系斑馬魚，成本降低至轉基因斑馬魚的幾十分之一，經濟性更明顯。此外，斑馬魚本身個體小，全身血量少，不容易采用常規方法檢測。本項目優化出斑馬魚肝癌的檢測手段，與之前多數研究的評價方式相比，采用斑馬魚體表和肝臟外觀肉眼觀察、肝腸指數檢測、石蠟切片HE 染色、肝臟血管新生率等方法，多維度評價斑馬魚肝癌的發生，可使評價方法更加完善和客觀。

由實驗數據可知，在DEN 暴露處理第3～4 周開始，實驗組斑馬魚體重變輕，游動減緩，但在大體外觀上與對照組斑馬魚無顯著差異，通過石蠟切片并進行HE 染色發現，實驗組斑馬魚肝臟細胞數量有增多現象;DEN 處理5～8 周時，觀察到實驗組部分斑馬魚出現脊柱彎曲現象，解剖時發現實驗組斑馬魚腹部出現油狀腹水且腹水情況隨著濃度的增大而加重，此外，肝臟顏色變淺，出現炎性細胞浸潤現象;DEN 處理9 周開始，實驗組斑馬魚魚鰭附近以及腹部存在腐爛情況，體表黏膩，魚鱗易脫落，部分個體有體表出血等現象，解剖時發現實驗組斑馬魚肝臟組織有明顯的變大變重，肝臟表面出現明顯的血管新生的現象，并且肝臟顏色變為淡黃色，與對照組斑馬魚肝臟的暗紅色相比有顯著差異。由于DEN 的強致癌性，毒性較大，實驗過程中會不斷有斑馬魚無法耐受而死亡。在斑馬魚肝臟模型的檢測中，受限于個體特征，斑馬魚本身的血流量較少，無法利用常規的肝癌檢測方法準確檢測，只能通過組織形態學與病理切片觀察。肝癌模型對肝組織進行組織形態學觀察可以明顯看到組織產生腫瘤，顆粒狀囊腫，整個肝臟邊緣模糊化，伴有一定的油狀腹水;HE 染色檢測結果顯示，對照組斑馬魚肝臟組織結構和細胞形態正常，細胞大小均一，肝細胞分布均勻，細胞核形態正常，未見明顯空泡。而DEN 給藥組肝細胞出現嚴重的破裂空洞的現象，肝細胞排列松散凌亂，大小不一。

此外，實驗中把肝臟血管新生的程度作為評價肝癌模型構建的指標之一，主要是考慮到腫瘤的產生過程中，需要大量的營養物質、生長因子和氧氣等支持細胞不斷增殖，而血管是運輸這些物質的主要載體。為獲取這些必需物質，腫瘤細胞誘導內皮細胞發生增殖、遷移、侵入、管形成等過程，因此，從血管新生的數量及程度可以間接評估出腫瘤的發生與進展［15］。

4 結論

采用DEN 作為肝癌誘導劑，在9 周內成功建立了斑馬魚肝臟癌癥模型，并在誘導過程中優化了誘導時間與給藥濃度，證明了DEN 在0～150 μg/mL 濃度范圍內能夠呈濃度依賴性地誘導斑馬魚肝腸指數的增加，促進肝臟的血管新生以及誘導斑馬魚肝臟的癌變過程。與傳統的動物模型相比，優化后的實驗模型具有經濟、高效、評價手段完善的特點，為進一步研究肝癌的發病機制及治療藥物的篩選提供了評價手段。