凝血酶抑制劑亭扎肝素對肺癌血管生成的抑制作用及分子機制研究

付文娜, 吳 瓊, 王慧莉

(1. 遼寧省盤錦遼油寶石花醫院, 遼寧 盤錦, 124010;2. 中國人民武裝警察部隊遼寧省總隊大連支隊勤務保障大隊衛生隊, 遼寧 大連, 116011)

目前，肺癌的發生率和病死率均較高，大多數患者就診時已發展至晚期或轉移期[1]。血管生成對腫瘤的生長和發展至關重要，可為腫瘤提供氧氣和營養，浸潤腫瘤細胞，并為其轉移提供途徑[2]。血管生成過程高度復雜，并受多種促血管生成和抗血管生成因子的調控，如血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和生長停滯特異性蛋白 6(Gas6)等[3-4]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占原發性肺癌的85%, 血管生成阻斷或可成為其有效的治療策略[5]。VEGF及血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)被認為是癌癥抗血管生成治療最重要的靶點之一，許多靶向VEGF/VEGFR2的單克隆抗體和抑制劑已被開發并應用于NSCLC的治療中，但效果不夠理想，患者5年生存率仍然很低[6]。凝血酶會影響VEGF的合成分泌，還會影響血管內皮細胞的通透性，使其功能紊亂。亭扎肝素是一種低分子量肝素(LMWH), 屬于凝血酶抑制劑，可抑制血管內皮細胞激活，從而抑制腫瘤生長，使患者存活率升高[7]。亭扎肝素還可調節黑色素瘤中VEGF和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表達，從而抑制血管生成[8]。本研究探討亭扎肝素對肺癌血管生成的抑制作用及分子機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～6周齡健康雄性裸鼠(BALB/cA-nu)30只購自廣州醫科大學實驗動物中心，均飼養于恒定濕度、溫度的無菌條件下。根據動物實驗研究報告指南(ARRIVE指南)，所有動物實驗經廣州醫科大學實驗動物倫理委員會審核批準。

1.2 細胞系培養

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購于Sciencell公司，人肺癌細胞系HCC827購于美國典型培養物保藏中心。HUVEC于含5%胎牛血清(FBS)和1%內皮細胞生長補充劑的內皮細胞培養基(ECM)試劑盒中培養。HCC827于含10%FBS的1640培養基中培養，并向培養基中加入100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。所有細胞均在37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養，并分為對照組(不加亭扎肝素)和10 U/L亭扎肝素組、20 U/L亭扎肝素組、50 U/L亭扎肝素組、100 U/L亭扎肝素組。

1.3 實驗材料

亭扎肝素購自Selleck公司，細胞計數試劑盒(CCK-8)購自 Beyotime公司。蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、VEGF、凝血酶和β-actin購自Cell Signaling Technology公司。血管內皮生長因子A(VEGFA)、CD31、Ki-67和辣根過氧化物酶偶聯的抗兔/小鼠IgG抗體購自ABclonal Technology公司。

1.4 細胞活力檢測

采用CCK-8法檢測細胞活力，將細胞置于96孔板上, 37 ℃培養過夜，與不同濃度藥物孵育72 h。加入CCK-8試劑，并將混合物在 37 ℃下孵育0.5～4.0 h。使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值。與對照組相比評價細胞生長速率，并使用GraphPad Prism 7.0軟件計算50%抑制濃度(IC50)值。

1.5 內皮細胞遷移實驗

亭扎肝素對HUVEC細胞遷移的影響使用Transwell小室進行評估。Transwell遷移實驗中，將無血清ECM的HUVEC懸浮后以2×104個/孔密度接種于板中，底部腔室充滿0.6 mL新鮮ECM。HUVEC細胞于37 ℃培養24 h。用棉簽除去膜表面的非遷移細胞后，用4%多聚甲醛固定, 0.1%結晶紫染色遷移至下膜表面的HUVEC。通過EVOS XL Core細胞成像系統拍照得到圖像，每個孔中隨機選擇3個視野，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析遷移細胞。

1.6 體外試管形成試驗

體外血管生成研究中，根據制造商(ibidi, 德國)說明書使用ibidi載玻片進行體外試管形成試驗。將200 000個HUVEC懸浮在1 mL M199培養基中，細胞培養基中補充有指定濃度的亭扎肝素。將細胞懸液(50 μL)加至每個載玻片孔中，并于37 ℃加濕室中孵育。在細胞接種后0、0.5、3、6、9 h, 以10倍放大率對管形成情況進行成像。9 h后，采用ImageJ軟件定量總管長。

1.7 網絡形成分析

在存在或不存在亭扎肝素的情況下，將HUVEC以2×104個/孔密度接種于96孔板。細胞在37 ℃、5%CO2條件下孵育6 h。使用EVOS XL Core細胞成像系統觀察和捕獲網絡，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量和分析。實驗重復3次。

1.8 主動脈環測定

通過主動脈環測定結果確定亭扎肝素的抗血管生成作用。從BALB/c小鼠中分離胸主動脈并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗。切除纖維脂肪組織后，將胸主動脈切成1.0～1.5 mm長的環，并將環接種在預涂Matrigel的96孔板中，再鋪上 80 μL Matrigel。溫育2 h后，將主動脈環用含亭扎肝素的新鮮ECM處理6 d。使用EVOS XL Core細胞成像系統觀察并拍攝發芽的微血管，使用ImageJ軟件對MVD進行量化。實驗獨立重復3次。

1.9 絨毛尿囊膜(CAM)檢測

對受精雞蛋進行CAM檢測，雞蛋已在 37 ℃下于濕度60%～65%的加濕孵化器中孵化5 d, 在毒氣室一側的蛋殼處切開1個約1 cm2的小窗口以開發人造毒氣室。分離殼和殼膜，以暴露 CAM。將CAM隨機分為對照組和亭扎肝素 0.2 mg/kg組，每組8個雞蛋。用透明膠帶密封窗口后，再將雞蛋孵化48 h。使用Olympus SZX18解剖顯微鏡觀察和捕獲CAM中的血管，并應用Image-Pro Plus 6.0軟件對微血管進行量化。

1.10 蛋白質印跡法(Western blot)分析

使用RIPA緩沖液裂解用或未用亭扎肝素處理的HUVEC和HCC827細胞，獲得全細胞提取物。使用NE-PERTM核和細胞質提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)分離細胞質和核蛋白，并使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)測定總蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質并轉移至聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore公司)。將膜與抗體一起孵育并使用增強的化學發光檢測系統進行檢測，采用ImageJ 軟件測量定量數據。實驗獨立重復3次。

1.11 體內小鼠異種移植試驗

將懸浮在100 μL Matrigel中的HCC827細胞(1×106個)接種到4～6周齡雄性裸鼠(BALB/cA-nu)右側皮下。當腫瘤長至100 mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為3組，每組5只。各組小鼠分別腹腔注射賦形劑、亭扎肝素60 IU/kg。根據公式(0.5×寬度2×長度)用卡尺進行2次垂直測量。實驗結束時，使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，切除腫瘤，稱重并拍照。將腫瘤用4%多聚甲醛固定，以進行下一步實驗。采用免疫組化方法檢測腫瘤組織中Ki-67、CD31和VEGFA表達情況。采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL法)檢測腫瘤組織中的凋亡細胞。

1.12 統計學分析

2 結 果

2.1 亭扎肝素對HUVEC增殖和遷移的影響

本研究采用增殖和遷移試驗評估亭扎肝素對HUVEC的抗血管生成作用，其中細胞活力測定可為進一步體外實驗提供合適的濃度。Tranwell遷移試驗顯示, 20、50、100 U/L亭扎肝素均可有效抑制HUVEC遷移，其細胞遷移距離與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1A; CCK-8檢測結果顯示，亭扎肝素以劑量依賴性方式降低HUVEC細胞活力，不同濃度亭扎肝素組間差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1B。以上實驗結果表明, 20 U/L亭扎肝素具有有效的抗血管生成作用。

A: 各組HUVEC細胞遷移距離比較; B: 各組HUVEC細胞活力比較。與對照組比較, *P<0.05; 與20 U/L亭扎肝素組比較,#P<0.05; 與50 U/L亭扎肝素組比較, △P<0.05。

2.2 亭扎肝素對體外和體內血管生成的影響

本研究采用網絡形成試驗和主動脈環試驗進一步驗證亭扎肝素的抗血管生成作用。網絡形成試驗顯示，相較于對照組, 20 U/L亭扎肝素可有效抑制HUVEC的管形成，管狀結構數量減少且管狀結構不穩定，差異有統計學意義(P<0.05)。主動脈環測定結果顯示，相較于對照組, 20 U/L亭扎肝素減少了血管生成，差異有統計學意義(P<0.01)。相較于對照組, 20 U/L亭扎肝素抑制了CAM模型中的新血管形成，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

A: 2組HUVEC管形成的網絡形成試驗結果(放大倍數400倍); B: 2組相對管型長度比較; C: 主動脈環測定HUVEC血管生成結果(放大倍數400倍); D: 2組HUVEC微血管數量比較; E: CAM模型中的新血管形成結果(放大倍數400倍); F: 2組CAM模型中微血管數量比較。與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。圖2 亭扎肝素對體外和體內血管生成的影響

2.3 亭扎肝素對VEGF和AKT的影響

Western blot檢測結果顯示, HUVEC和HCC827細胞中, 20 U/L亭扎肝素組的凝血酶含量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01); HCC827細胞中, 20 U/L亭扎肝素組的VEGF、p-Akt和Akt蛋白含量均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

A、B: HUVEC凝血酶含量的Western blot檢測結果; C～G: HCC827細胞中VEGF、凝血酶、p-Akt、Akt蛋白含量的Western blot檢測結果。與對照組比較, *P<0.05, **P<0.01。圖3 亭扎肝素抑制VEGF和AKT的激活

2.4 亭扎肝素對HCC827異種移植物中腫瘤

生長和腫瘤血管生成的影響

本研究通過HCC827異種移植物進一步驗證亭扎肝素的抗腫瘤和抗血管生成作用，發現20 U/L亭扎肝素組的腫瘤質量、腫瘤體積均小于對照組，差異有統計學意義(P<0.01), 表明亭扎肝素顯著抑制了腫瘤生長。進一步評估亭扎肝素對腫瘤增殖、細胞凋亡和血管生成的影響(采用TUNEL法檢測凋亡細胞，將Ki-67作為增殖標志物，將CD31和VEGFA作為血管內皮細胞標志物)，結果顯示，與對照組比較, 20 U/L亭扎肝素可抑制腫瘤增殖，促進腫瘤細胞凋亡，并抑制血管生成。見圖4。

A: 2組小鼠腫瘤質量比較; B: 不同給藥時間2組小鼠腫瘤體積比較; C: 2組小鼠腫瘤圖; D: Ki-67、凋亡細胞(TUNEL方法)、CD31和VEGFA的免疫組化檢測結果。與對照組比較, **P<0.01。圖4 亭扎肝素抑制HCC827異種移植物中的腫瘤生長和腫瘤血管生成

3 討 論

目前，肺癌的發病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類的生命健康。血管生成在腫瘤的發生發展中起著重要作用[9-11], 而VEGF/VEGFR是參與血管生成的關鍵信號通路[6]。亭扎肝素是一種凝血酶抑制劑，可抑制凝血酶表達。本研究發現，亭扎肝素不僅可抑制血管生成過程中HUVEC細胞運動(增殖、遷移和管形成)，還具有抗血管生成和抗腫瘤活性，而在腫瘤異種移植模型中，亭扎肝素也對腫瘤生長具有抑制作用。

細胞增殖和抵抗細胞凋亡是癌癥的兩大標志[12], 癌細胞通過自身產生生長因子或刺激正常細胞提供各種生長因子來促進增殖[13]。細胞凋亡是癌癥發展的天然屏障，但癌細胞已進化出多種方法來限制細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，亭扎肝素治療對體外和體內腫瘤細胞的增殖均具有抑制作用并可顯著誘導其凋亡。血管生成是癌癥的另一個重要標志，血管生成對其生理和病理生理過程至關重要，目前已有一些血管生成抑制劑被應用于臨床[15]。相關研究[16]在肺癌模型中研究抗凝血酶對腫瘤生長的抑制作用時發現，抗凝血酶的裂解構象具有強大的抗血管生成和抗腫瘤活性，完整抗凝血酶的穩定鎖定和潛伏形式的構象與分子的裂解形式基本相似，也在體內抑制血管生成和腫瘤生長，并選擇性地作用于內皮細胞和腫瘤血管系統。研究[17]顯示，凝血酶活性可促進血管生成，誘導血小板釋放VEGF, 并增加VEGF及其受體的表達，驅動腫瘤血管生成。本研究發現，亭扎肝素可抑制VEGF蛋白表達和體內體外的血管生成，且亭扎肝素可通過抑制細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡和抑制血管生成來抑制腫瘤生長。

Akt是VEGFR的重要下游信號分子，參與腫瘤細胞增殖、存活和血管生成[18]。本研究結果表明，亭扎肝素可顯著抑制Akt的磷酸化。本研究還發現，在HCC827異種移植模型中，亭扎肝素抑制了增殖標志物Ki-67, 增加了細胞凋亡，且亭扎肝素可抑制腫瘤生長，使血管標志物CD31顯著下降和VEGFA顯著減少，表明亭扎肝素可抑制HCC827異種移植物中的腫瘤生長和腫瘤血管生成。

綜上所述，凝血酶抑制劑亭扎肝素可抑制細胞增殖和血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，明顯抑制HCC827異種移植物中的腫瘤血管生成和腫瘤生長，其抗血管生成作用與Akt及其下游信號通路的失活有關，為進一步研究凝血酶抑制劑對肺癌血管生成的抑制作用提供了有力證據。