血清Mac-2結(jié)合蛋白聚糖異構(gòu)體對(duì)2型糖尿病患者肝纖維化的診斷價(jià)值

李 軍, 陳弘東, 譚 方, 潘慧釵, 徐筱青, 朱慶文

(北京市和平里醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 北京, 100000)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前全球范圍內(nèi)最常見的慢性肝病之一, 2型糖尿病(T2DM)患者的NAFLD發(fā)病率為49%～70%[1]。相關(guān)研究[2]指出, T2DM和NAFLD的共病機(jī)制主要與肝臟和外周胰島素抵抗有關(guān)。考慮到肝臟在T2DM病理生理學(xué)中的關(guān)鍵作用，鑒別肝纖維化具有重要的臨床價(jià)值。肝活檢是評(píng)估肝纖維化進(jìn)展階段的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在一些局限性，如侵襲性、取樣誤差、高檢測(cè)成本等[3]。血清生物學(xué)標(biāo)志物可為疾病的臨床診斷提供重要參考信息，有研究[4]顯示, Mac-2結(jié)合蛋白聚糖異構(gòu)體(M2BPGi)是一種新型肝纖維化標(biāo)志物，然而M2BPGi能否用于T2DM患者的肝纖維化篩查尚未完全明確。本研究評(píng)估血清M2BPGi對(duì)T2DM合并NAFLD患者肝纖維化進(jìn)展的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為病例對(duì)照橫斷面研究，招募2018年7月—2021年3月在北京市和平里醫(yī)院確診T2DM的272例患者為研究對(duì)象，男167例、女105例，年齡40～88歲。納入標(biāo)準(zhǔn): 年齡≥40歲，符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)》中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)者。排除標(biāo)準(zhǔn): 1型糖尿病患者; 妊娠期患者; 其他肝臟疾病患者; 合并腎臟疾病、重癥感染、惡性腫瘤者; 長(zhǎng)期服用肝毒性藥物者; 飲酒者(男性飲酒量>210 g/周，女性飲酒量>140 g/周)。詳細(xì)記錄272例患者的人口社會(huì)學(xué)資料、體檢資料、病程和藥物治療情況。NAFLD的診斷參照彌漫性肝細(xì)胞脂肪變的影像學(xué)或組織學(xué)證據(jù)，其中122例患者符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[5]中NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，男77例，女45例; 年齡40～88歲。另收集同期在北京市和平里醫(yī)院進(jìn)行健康體格檢查且年齡、性別與T2DM患者相匹配的150名健康志愿者的血清樣本作為正常對(duì)照，健康志愿者的各項(xiàng)體格檢查指標(biāo)結(jié)果均在正常值范圍內(nèi)，男91名，女59名; 年齡40～92歲。本研究經(jīng)北京市和平里醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲得參與者的書面知情同意。

1.2 分組方法

將150例無NAFLD的T2DM患者設(shè)為T2DM組，將122例T2DM合并NAFLD患者設(shè)為T2DM合并NAFLD組，將150名健康志愿者設(shè)為正常對(duì)照組。根據(jù)腹部彩色超聲檢查結(jié)果，計(jì)算NAFLD纖維化評(píng)分(NFS), 評(píng)估肝纖維化程度, NFS計(jì)算公式為-1.675+0.037×年齡+0.094×體質(zhì)量指數(shù)(BMI)+1.13×是否空腹血糖受損或糖尿病(是=1, 否=0)+0.99×[谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)]-0.013×血小板計(jì)數(shù)-0.66×白蛋白。根據(jù)NFS將T2DM合并NAFLD組患者分為無肝纖維化亞組[NFS<-1.455分(65歲以下)或<0.120分(65歲及以上)]、不確定亞組[NFS為-1.455～0.676分(65歲以下)或0.120～0.676分(65歲及以上)]和肝纖維化亞組(NFS>0.676分)。

1.3 M2BPGi定量方法

所有受試者均于禁食12 h后采集肘部靜脈血，離心后棄去下層沉淀物，取上層血清測(cè)定M2BPGi。采用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測(cè)M2BPGi水平, M2BPGiTM試劑盒和HISCL-5000型自動(dòng)免疫分析儀購(gòu)自日本Sysmex公司。將10 μL血清稀釋，然后與紫藤凝集素(WFA)包被的磁珠顆粒混合。磁分離和清洗后，添加堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的抗Mac-2結(jié)合蛋白(M2BP)單克隆抗體，然后加入化學(xué)發(fā)光底物試劑。根據(jù)測(cè)定對(duì)照品的光強(qiáng)度測(cè)量光強(qiáng)度并計(jì)算截止指數(shù)(C.O.I), M2BPGi C.O.I即血清M2BPGi相對(duì)濃度。M2BPGi C.O.I=(M2BPGi樣本-M2BPGi陰性對(duì)照)/(M2BPGi陽性對(duì)照-M2BPGi陰性對(duì)照)。陽性對(duì)照提供初步標(biāo)準(zhǔn)化的校準(zhǔn)溶液, C.O.I為1.0。

1.4 觀察指標(biāo)

抽取患者靜脈血約5 mL, 離心10 min, 3 000 轉(zhuǎn)/min, 分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman Coulter 公司，型號(hào)AU5800)檢測(cè)血清AST、ALT、總膽紅素(TBIL)、間接膽紅素(IBIL)、直接膽紅素(DBIL)等指標(biāo)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)這4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)水平，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海酶生物技術(shù)有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血清M2BPGi水平比較

正常對(duì)照組、T2DM組和T2DM合并NAFLD組的M2BPGi C.O.I分別為0.06(0.02, 0.10)、0.09(0.08, 0.15)和0.46(0.28, 0.91)。T2DM組、T2DM合并NAFLD組患者血清M2BPGi水平均高于正常對(duì)照組，且T2DM合并NAFLD組血清M2BPGi水平高于T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 血清M2BPGi對(duì)T2DM患者合并NAFLD的診斷效能

血清M2BPGi診斷T2DM患者合并NAFLD的曲線下面積(AUC)為0.919(95%CI為0.885～0.954), 截?cái)嘀禐?.795, 特異度、敏感度分別為0.873、0.869, 約登指數(shù)為0.742, 見圖1。

圖1 血清M2BPGi診斷T2DM患者合并NAFLD的ROC曲線

2.3 各亞組T2DM合并NAFLD患者臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)水平比較

不確定亞組、肝纖維化亞組ALT水平低于無纖維化亞組, AST/ALT、糖化血紅蛋白(HbA1c)、HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C、M2BPGi水平高于無纖維化亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 肝纖維化亞組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、TBIL、DBIL水平均高于無纖維化亞組、不確定亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 肝纖維化組ALT水平低于不確定亞組, AST/ALT、HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C、M2BPGi水平高于不確定亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 各亞組年齡、性別、糖尿病病程、BMI、腰圍、AST、IBIL、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 T2DM合并NAFLD患者臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較

2.4 血清M2BPGi對(duì)肝纖維化的診斷效能

血清M2BPGi診斷T2DM合并NAFLD患者肝纖維化的AUC為0.993(95%CI為0.983～1.000), 截?cái)嘀禐?.765, 特異度、敏感度分別為1.000、0.966, 約登指數(shù)為0.966, 見圖2。血清M2BPGi診斷肝纖維化的AUC均大于HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C單獨(dú)診斷的AUC(P<0.05), 見表2。

圖2 血清M2BPGi診斷T2DM合并NAFL患者肝纖維化的ROC曲線

表2 血清M2BPGi和4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)對(duì)肝纖維化的診斷效能

2.5 T2DM合并NAFLD患者血清M2BPGi水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清M2BPGi水平與HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C水平均呈顯著正相關(guān)(r=0.741、0.835、0.851、0.867,P<0.05), 與年齡(P=0.877)、糖尿病病程(P=0.117)、BMI(P=0.218)、AST(P=0.809)、ALT(P=0.233)、AST/ALT(P=0.413)、GGT(P=0.098)、TBIL(P=0.341)、DBIL(P=0.202)、IBIL(P=0.075)、HbAlc(P=0.436)、FBG(P=0.477)、TC(P=0.881)、FINS(P=0.075)均無相關(guān)性。

3 討 論

T2DM患者中有49%～62%可伴發(fā)NAFLD, 肥胖T2DM患者的NAFLD患病率更可高達(dá)70%[6]。近年來，醫(yī)學(xué)研究人員熱衷于尋找非侵入性的臨床診斷工具來篩查和評(píng)估T2DM合并NAFLD的肝纖維化進(jìn)程。M2BPGi是活化的肝星狀細(xì)胞(HSCs)合成的糖基化分泌蛋白，在胰島素抵抗、代謝紊亂和肝臟脂肪變性與纖維化的發(fā)展中起著重要作用。目前, M2BPGi相關(guān)研究多集中于細(xì)胞和分子水平層面，關(guān)于其在糖尿病患者中的應(yīng)用研究尚較少見。本研究發(fā)現(xiàn), T2DM患者血清M2BPGi較正常對(duì)照組顯著升高，而合并NAFLD的T2DM患者升高尤其顯著，當(dāng)血清M2BPGi≥0.795時(shí)可以敏感地區(qū)分T2DM患者是否合并NAFLD。本研究還發(fā)現(xiàn), T2DM合并NAFLD患者血清M2BPGi與4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)，提示血清M2BPGi可能成為篩查和評(píng)估T2DM合并NAFLD患者肝纖維化進(jìn)展的新指標(biāo)。

T2DM與NAFLD存在雙向關(guān)系，會(huì)共同導(dǎo)致不良代謝和心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。NAFLD通常被認(rèn)為是與代謝綜合征相關(guān)的肝臟疾病表現(xiàn)，胰島素抵抗是NAFLD和糖尿病的共同病理機(jī)制[7]。在高糖和毒性脂質(zhì)(如神經(jīng)酰胺、甘油三酯、游離脂肪酸和膽固醇)的影響下，肝臟發(fā)生糖脂毒性，接下來可能誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體應(yīng)激等多個(gè)機(jī)制而引發(fā)肝臟變性，繼而發(fā)展為肝纖維化[8]。過量的甘油三酯可增強(qiáng)線粒體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致自由基和過氧化物酶的釋放增加，此外脂肪細(xì)胞來源的細(xì)胞因子(瘦素、腫瘤壞死因子-α等)產(chǎn)生過多，而脂聯(lián)素水平不足，最終HSCs被激活，促進(jìn)膠原蛋白的產(chǎn)生以及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)的增加，導(dǎo)致肝臟纖維化和肝硬化。HSCs是肝源性細(xì)胞亞群中M2BPGi的主要來源，該細(xì)胞亞群中包括肝源性細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。體外研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，外源性 M2BPGi的加入上調(diào)了Kupffer細(xì)胞Mac-2的表達(dá)。以上研究從分子水平層面證明, M2BPGi是肝纖維化過程中由HSCs向Kupffer細(xì)胞發(fā)送的一種具有腎小球旁分泌作用的信使，因此可能是肝纖維化發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子。

M2BPGi也被稱為高糖基化WFA陽性M2BP, M2BP是具有多支化和唾液酸化的N-聚糖, WFA可識(shí)別N-聚糖和O-聚糖的半乳糖殘基和聚半乳糖結(jié)構(gòu)。M2BP存在于多個(gè)器官(如肝臟)的細(xì)胞外基質(zhì)和循環(huán)血清中，肝纖維化會(huì)導(dǎo)致M2BP的糖基化和糖鏈結(jié)構(gòu)的特異性修飾[12-13]。由此提示, M2BPGi水平應(yīng)該與肝纖維化進(jìn)展顯著相關(guān)。M2BPGi是近年來發(fā)現(xiàn)的預(yù)測(cè)肝纖維化的有效指標(biāo)，在病毒性肝炎肝纖維化、糖尿病肝纖維化和糖尿病血管病變的診斷中均具有較高的應(yīng)用價(jià)值。SALEH S A等[14]發(fā)現(xiàn), M2BPGi可用于無創(chuàng)評(píng)估和預(yù)測(cè)接受抗病毒藥物治療后出現(xiàn)上腔靜脈血栓的丙型肝炎患者的肝纖維化消退，且未治療時(shí)M2BPGi預(yù)測(cè)F4期肝纖維化患者具有最大的AUC。另外, HASHIMOTO Y等[15]證實(shí), (M2BPGi+1)的對(duì)數(shù)值與NAFLD纖維化分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。PARK H等[16]發(fā)現(xiàn)，血清M2BPGi水平隨著肝脂肪變性程度和纖維化程度的增加而升高，且血清M2BPGi水平與基于4因子的纖維化指數(shù)(FIB-4)、谷草轉(zhuǎn)氨酶-血小板比值指數(shù)(APRI)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示, T2DM患者中血清M2BPGi水平異常者更容易出現(xiàn)肝纖維化進(jìn)展，且與非肝纖維化的T2DM合并NAFLD患者比較，發(fā)生肝纖維化的患者血清M2BPGi水平顯著升高。肝纖維化由持續(xù)性肝損傷引起，以肝纖維化組織過度堆積和正常肝臟結(jié)構(gòu)變形為主要特征[17-18]。本研究中, T2DM合并NAFLD患者血清M2BPGi水平與HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C水平均呈顯著正相關(guān)，且血清M2BPGi診斷肝纖維化的AUC均大于HA、LN、PC Ⅲ、Ⅳ-C單獨(dú)診斷的AUC, 提示M2BPGi在評(píng)估T2DM患者肝纖維化方面具有一定優(yōu)勢(shì)。

綜上所述, T2DM合并NAFLD患者血清M2BPGi水平普遍升高，且M2BPGi水平與肝纖維化進(jìn)展有關(guān)。血清M2BPGi水平有助于篩查和評(píng)估T2DM合并NAFLD患者肝纖維化及進(jìn)展，有望成為該領(lǐng)域的新型診斷標(biāo)志物。