H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥葉片脂肪酸組成的影響

劉建新，劉瑞瑞，賈海燕，劉秀麗，卜 婷，李 娜

(甘肅省隴東生物資源保護利用與生態修復重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院,甘肅慶陽 745000)

土壤鹽堿化是限制農業發展的全球性生態問題[1]。脂肪酸是生物膜的重要組成成分，植物體內的脂肪酸通常不帶支鏈且多為偶數碳，其中以16和18碳脂肪酸居多[2]。研究表明，鹽脅迫下，植物脂肪酸含量和組成會發生改變[3]，并且不同植物通過膜脂比例及不飽和脂肪酸調控膜的通透性，從而賦予其不同的耐鹽能力[4]。Zhang等[5]指出，鹽脅迫下質膜的流動性與脂肪酸不飽和度呈正相關。Wu等[6]發現，膜脂飽和度的增加使生物膜更易形成凝膠態而降低膜流動性，從而減少Na+和Cl-的通透率。可見，植物脂肪酸組成對于植物的鹽堿適應性尤為關鍵，探究鹽堿脅迫下植物脂肪酸組成對深入了解植物耐鹽堿機制具有重要意義。

硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)是在生物體內發現的第3種氣體信號分子，它參與調控植物多種生理過程[7]，并能緩解干旱[8]、低溫[9]和重金屬[10]等逆境對植物的傷害。研究表明，內源H2S通過耦合氧化還原平衡和抑制K+外流能夠提高紫花苜蓿(Medicagosativa)耐鹽性[11]；外源H2S可維持鹽脅迫下黃瓜(Cucumissativus)Na+/K+平衡和提高氧化應激反應能力[12]；通過Na+/H+逆向轉運蛋白和H+-ATP酶基因表達調控維持大麥(Hordeumvulgare)Na+/K+平衡[13]；增強鹽脅迫茶樹(Camelliasinensis)抗氧化能力[14]；提高鹽脅迫小麥(Triticumaestivum)光合效能[15]。H2S是否參與鹽堿混合脅迫下植物脂肪酸組成的調控，迄今尚未見報道。裸燕麥(Avenanuda)是禾本科燕麥屬具有營養保健功能的西北優勢特色作物[16]，耐受鹽堿和土壤貧瘠的能力強[17]，其籽粒富含黃酮和膳食纖維，具有降低血清膽固醇和血糖的作用[18]。鹽堿混合脅迫是我國西部鹽堿化土地裸燕麥生長發育的重要限制因素。因此，本試驗模擬甘肅省中部裸燕麥種植地鹽堿環境，采用盆栽方式，通過葉面噴施H2S供體硫氫化鈉(NaHS)，研究外源H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥脂肪酸組成的影響，旨在為揭示H2S增強植物耐鹽堿機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4-8月在甘肅省隴東生物資源保護利用與生態修復重點實驗室科技園進行。供試材料為裸燕麥品種定莜9號，為2019年甘肅省定西市通渭縣什川鎮陽坡村試驗基地收獲的種子。NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3、NaHS和H2S合成抑制劑羥胺(hydroxylamine,HA)購自上海生物工程有限公司。模擬甘肅省中部裸燕麥種植地鹽堿含量和組成，按摩爾比為NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3=12∶8∶1∶9配制50 mmol·L-1鹽堿混合溶液(濃度由預試驗確定，pH=8.73)[19]。

1.2 試驗設計

挑選飽滿一致的定莜9號健康種子，用 2.0%(V/V)NaClO表面消毒10 min，自來水沖洗干凈后播種在配有底盤的塑料盆(口徑23 cm，高26 mm)中；以珍珠巖作基質，每盆播約50粒，澆水后露天培養；苗齊后定苗，每盆保留整齊壯苗20株。幼苗二葉期后用Hoagland營養液培養，培養至抽穗期進行試驗處理。

試驗設置7個處理：(1)對照(CK)：根部澆灌Hoagland營養液+葉面噴施蒸餾水；(2)鹽堿混合脅迫(salt-alkali mixed stress,SA)：根部澆灌含50 mmol·L-1鹽堿混合溶液的Hoagland營養液+葉面噴施蒸餾水；(3)SA+NaHS：根部澆灌含50 mmol·L-1鹽堿混合溶液的Hoagland營養液+葉面噴施50 μmol·L-1NaHS；(4)SA+HA：根部澆灌含1 mmol·L-1HA和50 mmol·L-1鹽堿混合溶液的Hoagland營養液+葉面噴施蒸餾水；(5)SA+NaHS+HA：根部澆灌含1 mmol·L-1HA和50 mmol·L-1鹽堿混合溶液的Hoagland營養液+葉面噴施50 μmol·L-1NaHS；(6)NaHS：根部澆灌Hoagland營養液+葉面噴施50 μmol·L-1NaHS；(7)HA：根部澆灌含1 mmol·L-1HA的Hoagland營養液+葉面噴施蒸餾水。

1.3 植株干重測定

采用烘干法測定植株干重[20]。

1.5 脂肪酸組分測定

1.5.1 樣品前處理

稱取樣本50 mg于2 mL離心管中，加1 mL氯仿-甲醇(2∶1)溶液，加入3顆鋼珠，放入高通量組織研磨儀中60 Hz震蕩1 min，重復2次；室溫超聲30 min，12 000 r·min-14 ℃離心5 min，取全部上清液于15 mL離心管中；加入2 mL 1%硫酸甲醇溶液，充分混勻震蕩1 min；80 ℃水浴鍋中酯化30 min；取出后冷卻，加入1 mL正己烷萃取；再加入5 mL ddH2O(4 ℃)洗滌，12 000 r·min-14 ℃離心10 min；吸取700 μL上清液于2 mL離心管中，再加入100 mg無水硫酸鈉粉末除去多余水分，振蕩混勻30 s，12 000 r·min-1離心5 min；精確吸取300 μL上清液于2 mL離心管中，加入15 μL 500×10-6g·mL-1水楊酸甲酯作內標，振蕩混勻10 s，精準吸取250 μL上清液加入到檢測瓶中。

1.5.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用檢測

用Trace 1310-ISQ 7000氣-質聯用儀(Thermo，美國)采集數據。色譜條件：色譜柱Thermo TG-FAME毛細管柱(50 m×0.25 mm ID×0.20 μm)；進樣量1 μL，分流比8∶1。進樣口溫度 250 ℃，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃。程序升溫起始溫度80 ℃，保持1 min；以20 ℃·min-1升至160 ℃，保持1.5 min；以3 ℃·min-1升至196 ℃，保持8.5 min；最后以20 ℃·min-1升至250 ℃，保持3 min。載氣為氦氣，載氣流速0.63 mL·min-1。MS條件：電子轟擊電離(EI)源，SIM掃描模式，電子能量70 eV。

1.5.3 定性定量分析

52種脂肪酸甲酯混標溶液用正己烷配置成0.5、1、5、10、25、50、100、250、500、1 000、2 000 μg·mL-1混合標準濃度梯度。母液保存于 -80 ℃，工作標準溶液現配現用。對脂肪酸標準液的系列濃度分別進行GC-MS檢測，以標準品的濃度為橫坐標，標準品與內標的峰面積比值為縱坐標得到各物質的線性回歸方程。根據建立的樣品前處理及儀器分析方法，對所有樣品進行定量分析，得到各脂肪酸含量，并計算脂肪酸不飽和度(UFA/SFA)和雙鍵指數(double bond index,DBI)，計算公式：UFA/SFA=不飽和脂肪酸(UFA)總量/飽和脂肪酸(SFA)總量；DBI=[Σ(UFA含量×雙鍵數)]/SFA總含量。

1.6 數據分析

運用Excel 2007整理數據，用SPSS 20.0和Duncan進行方差分析和多重比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 H2S對鹽堿混合脅迫下定莜9號葉片和MDA含量及植株干重的影響

表1 不同處理下裸燕麥葉片和MDA含量及植株干重Table 1 Contents of H2O2 and MDA in leaves and plant dry weight of Dingyou 9 under different treatments

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters above columns mean significant difference among treatments(P<0.05).The same below.圖1 不同處理下裸燕麥葉片總脂肪酸含量Fig.1 Total fatty acid content in naked oat leaves under different treatments

2.2 H2S對鹽堿混合脅迫下定莜9號葉片總脂肪酸含量的影響

如圖1所示，CK處理葉片中脂肪酸含量為 3 523.16 μg·g-1FW；SA處理的脂肪酸含量為 3 177.01 μg·g-1FW，與CK相比顯著降低；與SA處理相比，SA+NaHS處理下脂肪酸含量顯著下降(7.71%)。SA+HA處理的脂肪酸含量與SA處理相比無顯著差異。與SA+NaHS處理相比，SA+NaHS+HA處理的脂肪酸含量顯著提高(7.26%)。單獨NaHS或HA處理與CK相比，脂肪酸含量均顯著降低。

2.3 H2S對鹽堿混合脅迫下定莜9號葉片脂肪酸組分含量的影響

由表2可知，CK處理葉片中共檢測到50種脂肪酸組分，其中含量大于50.00 μg·g-1FW的組分有7種，表現為C16∶0(棕櫚酸)>C18∶3N3(α-亞麻酸)>C18∶0(硬脂酸)>C20∶1(順-11-二十碳烯酸)>C18∶2N6(亞油酸)>C15∶1T(反-10-十五烯酸)>C14∶1T(反-9-肉豆蔻烯酸)。其中C16∶0的含量占總脂肪酸含量的33.77%，C18∶3N3和C18∶0分別占總脂肪酸含量的 22.91%和19.87%；C20∶1和C18∶2N6的含量占比分別是6.01%和 4.06%；C15∶1T和 C14∶1T的含量占比分別為2.14%和1.62%。C10∶0(癸酸)、C11∶0(十一烷酸)、C21∶0(二十一烷酸)和C23∶0(二十三烷酸)4種脂肪酸的含量小于1.00 μg·g-1FW，均低于總脂肪酸含量的0.02%。另外，有39種脂肪酸的含量在 1.00～50.00 μg·g-1FW，占總脂肪酸含量的 9.58%。

不同處理引起定莜9號葉片脂肪酸組分含量發生明顯變化(表2)。與CK相比，SA處理的C12∶0和C23∶0兩種脂肪酸含量顯著升高；C13∶0、C14∶1T等20種脂肪酸含量顯著下降，其中5種脂肪酸(C14∶1T、C16∶0、C18∶0、C18∶2N6和C18∶3N3)含量大于50.00 μg·g-1FW，其他15種脂肪酸含量均在1.00～ 50.00 μg·g-1FW之間；另有28種脂肪酸含量無顯著變化。與SA處理相比，SA+NaHS處理使5種脂肪酸C16∶0、C18∶1N12、C18∶1N7、C18∶2N6和C18∶3N3含量顯著下降，其中有3種脂肪酸C16∶0、C18∶2N6和C18∶3N3含量在50.00 μg·g-1FW以上，2種脂肪酸C18∶1N12和C18∶1N7含量在10.00～20.00 μg·g-1FW之間；其他45種脂肪酸含量變化不顯著。與SA處理相比，SA+HA處理下C8∶0、C14∶1T等21脂肪酸含量顯著下降，29種脂肪酸含量變化不顯著。與SA+NaHS處理相比，SA+NaHS+HA處理的5種脂肪酸C12∶0、C15∶1T、C18∶2N6、C18∶3N3和C23∶0含量顯著提高，8種脂肪酸C18∶0、C18∶1N7T、C18∶1N12、C18∶1N7、C20∶2、C20∶3N6、C24∶1和 C22∶4含量顯著下降，其他37種脂肪酸含量變化不大。與CK相比，單獨NaHS或HA處理僅使脂肪酸 C18∶3N6和C20∶1含量有所升高，而其他脂肪酸含量均呈現不顯著或顯著降低趨勢。

表2 H2S對鹽堿混合脅迫下裸燕麥葉片脂肪酸組分含量的影響Table 2 Effect of H2S on the fatty acid component contents in naked oat leaves under salt-alkali stress μg·g-1 FW

2.4 H2S對鹽堿混合脅迫下定莜9號葉片飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量的影響

如圖2顯示，與CK相比，SA處理使定莜9號葉片飽和脂肪酸(SFA)和不飽和脂肪酸(UFA)含量顯著下降；與SA處理相比，SA+NaHS處理對SFA含量無顯著影響，但顯著降低了UFA含量。SA+HA處理的SFA和UFA含量與SA處理相比均無顯著差異。SA+NaHS+HA處理相比SA+NaHS處理的SFA含量變化不大，而UFA含量顯著提高。單獨NaHS或HA處理與CK相比，SFA含量均顯著降低；單獨NaHS處理的UFA含量與CK的差異不顯著，單獨HA處理的UFA含量顯著降低。

圖2 不同處理下裸燕麥葉片飽和脂肪酸(A)和不飽和脂肪酸(B)含量Fig.2 Saturated fatty acid(A)and unsaturated fatty acid(B)contents in naked oat leaves under different treatments

2.5 H2S對鹽堿混合脅迫下定莜9號葉片脂肪酸不飽和程度的影響

脂肪酸不飽和度(UFA/SFA)和雙鍵指數(double bond index,DBI)反映脂肪酸不飽和水平。由圖3可見，與CK相比，SA處理下定莜9號葉片UFA/SFA和DBI略有下降，但與CK的差異不顯著；與SA處理相比，SA+NaHS處理使UFA/SFA和DBI均顯著降低。SA+HA處理的UFA/SFA和DBI與SA處理相比均有所提高，但未達到顯著水平。SA+NaHS+HA處理與SA+NaHS處理相比，UFA/SFA和DBI均顯著提高。單獨NaHS或HA處理的UFA/SFA顯著高于CK，而DBI與CK的差異不顯著。

圖3 不同處理下裸燕麥葉片的脂肪酸不飽和度(A)和雙鍵指數(B)Fig.3 Unsaturated degree of fatty acids(A)and double bond index(B)in leaves of naked oat under different treatments

3 討 論

研究證明，維持細胞膜結構的完整性和穩定性是植物抵抗鹽堿脅迫的重要特征[26-27]。脂肪酸是生物膜結構的重要組成成分，脂肪酸組成與生物膜穩定性密切相關[28]。隨著鹽、堿脅迫強度增大，草地早熟禾(Poapratensis)不飽和脂肪酸含量下降，飽和脂肪酸含量上升[29]。鹽脅迫下大麥根系液泡膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例增加，液泡膜流動性降低[30]。本試驗表明，鹽堿混合脅迫顯著降低了裸燕麥葉片飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸和總脂肪酸含量及脂肪酸不飽和度和雙鍵指數，增添HA對上述脂肪酸含量和脂肪不飽和度無顯著影響(圖1-3)。說明脂肪酸含量改變是裸燕麥適應鹽堿逆境的一種重要生理機制，這一過程中抑制H2S合成不會改變脂肪酸水平。究其原因，可能是鹽堿混合脅迫引起質膜NADPH氧化酶活性升高，產生大量活性氧攻擊細胞膜系統[31]，造成膜脂不飽和脂肪酸雙鍵斷裂形成脂質氫過氧物，使不飽和脂肪酸組分含量下降；而抑制H2S的生成沒有對此過程產生影響。鹽堿混合脅迫下外施NaHS顯著降低了裸燕麥不飽和脂肪酸和總脂肪酸含量，使脂肪酸不飽和度和雙鍵指數顯著下降，而飽和脂肪酸含量變化不明顯；添加HA后顯著逆轉了NaHS的上述作用。這表明外源H2S不僅可以降低鹽堿混合脅迫下裸燕麥不飽和脂肪酸含量，而且能夠有效降低脂肪酸不飽和水平。有研究表明，膜脂飽和度的增加會使生物膜更易從液晶態轉化為凝膠態而降低膜流動性，從而減少對Na+、Cl-的通透性[6]，阻止質膜對鹽分的透入和液泡中鹽分向細胞質的返回，增強植物抗鹽性[32]。大量研究證實，H2S能夠增強植物抗鹽性[11-15]。本研究結果證實H2S能夠增強裸燕麥耐受鹽堿混合脅迫的能力。由此推測，H2S降低膜脂不飽和脂肪酸含量和膜脂不飽和度是提高植物鹽堿耐性的重要機制之一。脂肪酸不飽和度的調節通過脂肪酸去飽和酶實現，不同類型脂肪酸去飽和酶催化脂肪酸鏈特定位置形成雙鍵，生成不飽和脂肪酸[33-34]。越來越多的研究證明，依賴于H2S的蛋白質硫巰基化修飾參與調節植物新陳代謝和形態建成[35]。外源H2S降低裸燕麥不飽和脂肪酸含量的可能原因是H2S通過脂肪酸去飽和酶蛋白關鍵Cys巰基 (-SH)修飾化為硫巰基(-SSH)，從而使其活性下降所致，但具體機制尚需進一步探討。

前人研究發現，施用適宜濃度H2S可以維持植物Na+/K+平衡和增強抗氧化能力[11-14]，提高光合活性[15]，誘導植物耐鹽堿性增強[36]。然而，上述研究主要關注H2S對植物離子平衡、抗氧化防御及光合過程的影響，而對H2S調控植物脂肪酸代謝的研究未見報道。本試驗發現，裸燕麥葉片中的主要脂肪酸有7種，分別是棕櫚酸 (C16∶0)、α-亞麻酸(C18∶3N3)、硬脂酸 (C18∶0)、順-11-二十碳烯酸(C20∶1)、亞油酸(C18∶2N6)、反-10-十五烯酸(C15∶1T)和反-9-肉豆蔻烯酸 (C14∶1T)，其含量總和占檢出50種脂肪酸組分總量的90.38%(表2)。鹽堿混合脅迫使月桂酸(C12∶0)和二十三烷酸(C23∶0)含量升高；十三烷酸 (C13∶0)、反-9-肉豆蔻烯酸 (C14∶1T)等20種飽和或不飽和脂肪酸組分含量降低。增添HA后使辛酸(C8∶0)、反-9-肉豆蔻烯酸(C14∶1T)等21種脂肪酸組分含量顯著下降。說明鹽堿混合脅迫下內源H2S參與裸燕麥脂肪酸合成和轉化調控。外施H2S不僅影響鹽堿混合脅迫下裸燕麥總脂肪酸含量，還使脂肪酸組分含量發生顯著改變。其中棕櫚酸 (C16∶0)、巖芹酸(C18∶1N12)、異油酸(C18∶1N7)、亞油酸(C18∶2N6)和α-亞麻酸 (C18∶3N3)含量顯著下降。添加HA后月桂酸(C12∶0)、反-10-十五烯酸(C15∶1T)、亞油酸(C18∶2N6)、α-亞麻酸(C18∶3N3)和二十三烷酸(C23∶0)含量提高；硬脂酸(C18∶0)、反異油酸(C18∶1N7T)、巖芹酸(C18∶1N12)、異油酸 (C18∶1N7)、順-11,14-二十碳二烯酸(C20∶2)、HOMO-γ-亞麻酸 (C20∶3N6)、神經酸(C24∶1)和順-7,10,13,16-二十二碳四烯酸(C22∶4)含量下降。可見，外源H2S主要影響鹽堿混合脅迫下裸燕麥12～24碳鏈長脂肪酸組分水平。關于這一變化的機理，未見文獻報道。而脂肪酸合成酶和去飽和酶是控制脂肪酸組分含量變化的關鍵，進一步研究H2S對脂肪酸合成相關酶基因的表達調控將是揭示H2S影響鹽堿混合脅迫下植物脂肪酸組分變化的重點。

4 結 論