HIF-1α與MALAT-1在三陰型乳腺癌中的表達及其相關性分析

李澤群 何艷 唐劍

廣東深圳市龍崗中心醫院 1)甲乳血管外科 2)病理科 3)婦科 深圳 518116

三陰型乳腺癌(TNBC)是癌組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2(HER-2)均呈陰性表達的乳腺癌，其發生率占乳腺癌所有病理類型的10.0%～20.8%。TNBC臨床以侵襲性病程為主要表現，與其他乳腺癌類型比較，發生遠處轉移的風險較大且預后較差[1]。缺氧誘導因子-1(HIF-1)是一種具有轉錄活性的核蛋白，主要由HIF-1α與HIF-1β組成，其中α是由缺氧誘導的活性亞基，具有調節活性的功能[2]。大量文獻表明[3-4]，HIF-1α能在眾多腫瘤疾病組織中呈高表達，且與腫瘤組織的血管生成、侵襲轉移、放化療的抵抗性等密切相關。MALAT-1能夠參與并調控腹膜纖維化的進展，且MALAT-1在乳腺癌患者中呈異常表達，能參與癌細胞的遷移、侵襲及增殖，但目前對于兩者在TNBC患者中的表達與相關性研究鮮有。鑒于此，本研究擬分析HIF-1α與MALAT-1在TNBC中的表達及其相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析2010-10—2020-10我院收治的63例TNBC患者的臨床資料。納入標準：(1)符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2017年版)》[5]中的相關標準，ER、PR及Her-2檢查均為陰性。(2)均為女性患者。(3)臨床資料完整。排除標準：(1)術前已接受放化療、內分泌等相關治療者。(2)合并其他部位惡性腫瘤者。(3)妊娠或哺乳期患者。年齡(45.46±8.79)歲(范圍：36～54歲)。臨床TNMⅠ期35例，Ⅱ期22例，Ⅲ期6例。有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移42例。

1.2方法

1.2.1 MALAT-1染色與判定 采用SP法檢測HIF-1α。對手術切除的癌組織及癌旁組織標本進行低聚甲醛固定，采用石蠟包埋，連續切片、脫蠟、水化、抗原修復，血清封閉后進行4℃的孵育過夜。二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色，采用蘇木精進行復染后進行反藍沖洗。采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)代替一抗做陰性對照。結果以染色強度與陽性細胞百分比進行判定，若細胞核或細胞質無染色或輕微染色則為陰性；若細胞核或細胞質染色較強，且陽性細胞數比例≥50%，或細胞核(或細胞質)出現強染色且陽性細胞數比例≥10%，則為陽性。

1.2.2 引物合成 選擇甘油醛-3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)，所有引物選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)純化級別。MALAT-1上游引物為5’-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T3’；下游引物為5’-TGC CGA CCT CAC GCA GGA TTT T-3’，擴增產物片段長度為93 bp。HIF-1α上游引物為5’-TCC AAG CCC TCC AGG TAT-3’；下游引物為5’-ATG CTA AAT CCC TCC AAG TAT-3’；下游引物為5’-ATG CTA AAT CGC AGG GTA-3’，擴增產物片段長度為568 bp。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol法提總RNA，所有操作嚴格按照說明書進行。B-500超微量紫外可見分光光度計測定RNA濃度，2.0μL5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500ng總RNA，加入10μL RNaes Free ddH2O，PCR儀42℃進行2 min水浴。反轉錄合成cDNA放置于-80℃的冰箱中保存待檢，PCR反應體積為20 μL，其中SYBR Green PCR Master Mix10μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL；cD-NA模板2 μL，RNase free水為6.8 μL。循環參數：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共循環40次。采用2-△△CT法獲得MALAT-1與HIF-1αmRNA的表達水平。

2 結果

2.1HIF-1α蛋白陽性率和MALAT-1、HIF-1α表達水平癌組織的HIF-1α陽性率高于癌旁組織， MALAT-1、HIF-1α的表達水平均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 TNBC癌組織與癌旁組織HIF-1α蛋白陽性率及MALAT-1、HIF-1α表達水平比較

2.2TNBC患者MALAT-1與HIF-1α表達水平相關性分析經雙變量Pearson直線相關檢驗結果顯示，TNBC患者MALAT-1與HIF-1α呈正相關(r=0.358，P<0.05)。

3 討論

TNBC的病因尚未完全明確，多認為與乳腺癌相關基因(BRCA1/2)導致疾病突變密切相關。文獻資料表明[6]，乳腺癌患者中部分IncRNA能夠通過對下游靶基因的調節作用而促進癌細胞的增殖，且能通過與體內的受體某些片段DNA結合對受體的表達造成影響，最終導致腫瘤細胞的凋亡敏感性發生改變，但仍局限于對乳腺癌組織或細胞中。因此，尋找新的生物學標記物對了解TNBC的復發與轉移機制，提高TNBC患者的生存率，減少復發與轉移具有重要意義。

本研究結果顯示，癌組織的HIF-1α陽性率高于癌旁組織，且癌組織MALAT-1和HIF-1α表達水平高于癌旁組織。結果提示癌組織的MALAT-1、HIF-1α呈高水平表達。這可能是由于在腫瘤細胞的微環境中，腫瘤新生血管無法滿足無限增殖的腫瘤細胞，進而出現氧濃度降低，其中天冬酰氨胺羥化酶(PHDs)、脯氨酸羥化酶(PH)相繼失活，導致下游靶基因HIF-1α轉錄被激活。HIF-1作為臨床具有轉錄活性的核蛋白，與靶基因結合后能夠通過轉錄與轉錄后的調控作用導致機體發生有適應代償性質，或病理性損害的反應。Soni S[7]等通過對HIF-1在生物學和治療癌癥中近20年重要文獻分析發現，HIF-1作為網絡樞紐可協調影響腫瘤發生的多種信號分子活動，在腫瘤組織的血管生成、能量代謝，以及侵襲轉移中有重要的地位。其可在多種腫瘤組織中呈異常表達，且與腫瘤的轉移及預后密切相關。Wang Y[8]等通過對Malat-1表達升高對乳腺癌患者長期不良預測的Mate分析發現，其對乳腺癌患者的生存結局有重要預測作用，本研究結果與之近似。進一步經雙變量Pearson直線相關檢驗，結果顯示，TNBC患者MALAT-1與HIF-1α呈正相關。提示HIF-1α表達水平越高，則MALAT-1的表達越高。分析原因，可能是由于MALAT-1能夠作用于G2/M細胞周期，可經P13K/mTOR通路對細胞的增殖與凋亡進行調控，進而參與TNBC的發生與發展[9]。HIF-1α則在低氧反應下與反應元件結合，激活下游靶基因的轉錄表達，從而呈高水平表達。

綜上所述，TNBC患者的HIF-1α與MALAT-1的表達水平呈正相關，臨床可加強對兩者水平的監測，以判斷病情的嚴重程度。