十棗湯對肺纖維化大鼠肺組織層粘連蛋白和血小板衍生生長因子表達的影響

牛曉 王燕青 逄舒婷 宋潤琪 趙曉婷

摘要 目的：通過檢測博來霉素誘導肺纖維化大鼠肺組織層粘連蛋白（LN）和血小板衍生生長因子（PDGF）的水平，初步探討十棗湯抗肺纖維化可能的作用機制。方法：以雄性無特定病原體（SPF）級SD大鼠為研究對象，將96只SD大鼠隨機分為6組：空白組、模型組、吡啡尼酮組、十棗湯低劑量組、十棗湯中劑量組、十棗湯高劑量組，每組16只。采用氣管內注入博萊霉素的方法建立肺纖維化模型。造模后第2天，空白組及模型組大鼠每日灌胃生理鹽水2 mL，吡非尼酮組每日灌胃吡非尼酮溶液2 mL，十棗湯低、中、高劑量組分別灌胃低、中、高濃度的十棗湯2 mL，每周3次，其余時間每日灌胃生理鹽水2 mL。于第14天各組隨機處死8只大鼠（模型組、十棗湯低劑量組7只），第28天處死其余大鼠，取肺組織。HE染色觀察肺組織病理學變化，ELISA法檢測肺組織中LN和PDGF的濃度。結果：與空白組比較，模型組出現典型肺纖維化改變，肺組織中LN和PDGF表達水平明顯升高（均P<0.01）;與模型組比較，各藥物觀察組肺纖維化程度明顯減輕，肺組織LN和PDGF的表達水平明顯降低（均P<0.01）;十棗湯高劑量組肺組織LN和PDGF的表達水平較其他組顯著降低（均P<0.01）。吡啡尼酮組與十棗湯中劑量組大鼠肺組織LN及PDGF表達水平差異無統計學意義（均P>0.05）。結論：十棗湯能夠改善博來霉素所致大鼠肺纖維化，其作用機制可能與抑制肺組織中LN和PDGF的表達有關。

關鍵詞 特發性肺纖維化;十棗湯;層粘連蛋白;血小板衍生生長因子;博來霉素;SD大鼠;吡非尼酮;峻下逐水法

Effect of Shizao Decoction on Expression of LN and PDGF in Lung Tissues of Rats with Pulmonary Fibrosis

NIU Xiao1，WANG Yanqing2，PANG Shuting3，SONG Runqi4，ZHAO Xiaoting1

（ Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250000，China; 2 Hiser Medical Center of Qingdao，Qingdao 266000，China; 3 The West Coast New District Second Traditional Chinese Hospital，Qingdao 266000，China; 4 Jiaozhou People′s Hospital，Qingdao 266000，China）

Abstract Objective：To investigate the underlying mechanism of Shizao Decoction against bleomycin-induced idiopathic pulmonary fibrosis in rats based on the levels of laminin（LN） and platelet-derived growth factor（PDGF）.Methods：A total of 96 SPF SD rats were randomized into the blank group，model group，pirfenidone group，and low-dose，medium-dose group，and high-dose Shizao Decoction groups，with 16 in each group.Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin.From the second day after modeling，rats in the blank group and the model group were given（i.g.） 2 mL normal saline each day and those in the pirfenidone group received（i.g.） 2 mL of pirfenidone solution each day.Moreover，and 2 mL of low-，medium-，and high-concentration of Shizao Decoction was given（i.g.） to the three Shizao Decoction groups，respectively，three times a week，and 2 mL of normal saline was given for the rest of the time.Eight rats（7 in model group and low-dose Shizao Decoction group） were killed in each group on the 14th day and the rest were killed on the 28th day.Lung tissues were collected and the pathological changes were observed based on hematoxylin-eosin（HE） staining.The concentration of LN and PDGF in lung tissues was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Compared with the blank group，the model group showed typical pulmonary fibrosis and increase in the concentration of LN and PDGF in lung tissues（P<0.01）.Compared with the model group，the administration groups demonstrated significant alleviation of pulmonary fibrosis and obvious reduction in the concentration of LN and PDGF in lung tissues（P<0.01）.The concentration of LN and PDGF in lung tissues in high-dose Shizao Decoction group was lower than that in other groups（P<0.01）.The levels of LN and PDGF in lung tissues were insignificantly different between the pirphenidone group and the medium-dose Shizao Decoction group（P>0.05）.Conclusion：Shizao Decoction relieves the bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats by inhibiting the expression of LN and PDGF in lung tissues.

Keywords Idiopathic pulmonary fibrosis; Shizao Decoction; LN; PDGF; Bleomycin; SD rats; Pirphenidone; Drastic hydragogue method

中圖分類號：R289.4;R563文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.017

特發性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一種特殊的慢性進行性間質性肺疾病。IPF病因不明，臨床表現為漸進性的呼吸困難和肺功能惡化，是呼吸系統常見的難治性疾病。其發病率逐年上升，致死率高，根據有關統計，確診后患者5年生存率僅為20%[1]。現代醫學對其有研究，但均無重大進展[2]。實驗表明，層粘連蛋白（Laminin，LN）和血小板衍生生長因子（Platelet-derived Growth Factor，PDGF）與IPF病情進展密切相關[3-4]。目前西醫采用抗纖維化、激素及免疫抑制劑等治療IPF，但其臨床不良反應多，費用高，遠期療效不穩定[5]。近年來，中醫藥治療IPF取得較大進展[6]。目前，導師在臨床上應用十棗湯制劑治療IPF，發現十棗湯能夠有效改善患者的臨床癥狀，提高患者的生命質量，明顯延長患者生存期。本實驗采用博來霉素復制肺纖維化大鼠模型[7-8]，觀察大鼠肺組織中LN和PDGF表達情況，探討十棗湯抗肺纖維化的可能的作用機制，以期為臨床治療提供借鑒。

材料與方法

1. 材料

1.1. 動物 選用雄性無特定病原體（SPF）級SD大鼠96只，由北京華阜康生物科技股份有限公司購入，8周齡，體質量（200±20）g。在相對空氣濕度為20%、室溫在18～22 ℃的環境中，自由進食、飲水，常規適應性喂養1周后開始實驗。

1.1.2 藥物 十棗湯，制備方法如下：大棗、甘遂、大戟、芫花4味中藥由青島市海慈醫療集團中藥房提供，后3味研成細末過篩100目，按照1∶1∶1的比例等分。用藥劑量按人與大鼠每公斤體質量折算系數計算[9]，十棗湯低、中、高生藥劑量分別為：0.18 g/kg，0.9 g/kg，1.8 g/kg，棗湯調制后十棗湯低、中、高的藥物濃度分別為：18 mg/mL，90 mg/mL，180 mg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 注射用鹽酸博萊霉素（海正輝瑞制藥有限公司，批號：Y20262，配制成為5 mg/mL的溶液）、吡非尼酮（北京康蒂尼藥業有限公司，國藥準字H20133376，批號：170801，溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液配成5 mg/mL）、羧甲基纖維素鈉（麥克林生物品牌，CAS：9004-32-4黏度：1500-3100 mpa.susp Grade，批號：A18105）、水合氯醛（武漢博萊特化工有限公司，批號：C0073）、層粘連蛋白（LN）ELISA檢測試劑盒（博士德生物有限公司提供，貨號：EKO435）、血小板衍生生長因子（PDGF）ELISA檢測試劑盒（博奧森生物有限公司提供，貨號：bs-0196R-100 μL）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，貨號：G1120-100 mL）、實驗超低溫冷凍儲存冰箱（中科美菱，型號：DW-HL398）、電熱恒溫培養箱（山東濰坊精鷹醫療器械有限公司，型號：YLA-2000）、普通光源顯微鏡（奧林巴斯，型號：CX21）、多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司，型號：iMark）。

1.2 方法

1.2. 分組及模型制備 采用隨機分組方法，將大鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、吡非尼酮組、十棗湯低劑量組、十棗湯中劑量組、十棗湯高劑量組，每組16只。模型組及各藥物組采用氣管插管的方式，向大鼠氣管中灌注博來霉素，復制大鼠肺纖維化模型。10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射大鼠進行全身麻醉，使用輸液用泵前軟管行氣管插管，在大鼠吸氣瞬間將博來霉素（0.2 mL/只）迅速推入，再向氣管內注入少量氣體，使博來霉素完全進入到氣管內，拔出軟管，將大鼠直立并旋轉數次，使藥物快速、均勻地分散到肺組織。空白組應用生理鹽水行氣管插管處理。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天采用灌胃方式給藥，1次/d。吡非尼酮組給予吡啡尼酮2 mL/d;十棗湯低、中、高劑量組，給予低、中、高劑量十棗湯2 mL灌胃，每周3次，其他時間2 mL生理鹽水灌胃;空白組及模型組大鼠每天2 mL生理鹽水灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法 觀察大鼠的一般情況、觀察肺組織病理變化、檢測肺組織中LN及PDGF表達水平。造模后第14天各組隨機處死8只大鼠（模型組、十棗湯低劑量組7只）、第28天處死其余大鼠。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，暴露胸腔。取右肺，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規進行脫水、透明、石蠟包埋、切片，制成病理切片，用于HE染色，觀察肺組織的病理變化;取左肺，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈，并將其切割成合適大小，放入EP管中，于-80 ℃冰箱儲存，酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測肺組織中LN及PDGF含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，符合正態分布及方差齊性，則進行單因素方差分析，多重比較用LSD法;若方差不齊性，采取秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 大鼠一般情況 造模第2天，模型組死亡1只，十棗湯低劑量組死亡1只，其余大鼠均未死亡。空白組大鼠：活動靈敏，精力充沛，毛色光澤，目光靈活，呼吸均勻，進食、飲水及排便正常，體質量增長正常。模型組大鼠：少動，反應遲鈍，毛色晦暗枯槁，目光呆滯，喘憋較重，可聞及喘鳴，部分大鼠呈直立呼吸，進食減少，無明顯體質量增長。十棗湯低、中劑量組、吡非尼酮組、十棗湯高劑量組大鼠：活動較好，精神可，反應較靈敏，皮毛欠光澤，目光較靈活，呼吸欠均勻，進食飲水正常，排稀軟樣便，體質量增長正常。

2.2 各組大鼠肺組織病理學表現

光鏡下觀察，空白組大鼠肺組織無明顯病理改變，肺泡結構清晰，肺泡壁完整，間隔未見明顯增厚，未見滲出物及炎癥細胞浸潤。模型組第14天時肺間質及肺泡腔可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構松散，間隔增厚。第28天時炎癥滲出較第14天時減少，肺泡間隔明顯增寬，肺泡結構被破壞，肺泡腔消失并出現病理性融合擴張，大量成纖維細胞增殖。十棗湯低劑量組較模型組肺纖維化程度減輕，可見炎癥細胞浸潤，肺泡結構部分完整，肺泡間隔增寬。十棗湯中劑量組及吡非尼酮組的肺組織較模型組纖維化程度明顯減輕，肺泡結構較為完整，偶見肺泡間隔增寬，病變較為局限。十棗湯高劑量組肺組織纖維化程度最輕，肺泡結構完整。見圖1。

2.3 各組大鼠肺組織LN和PDGF表達水平

2.3. 給藥第14天時大鼠肺組織中LN、PDGF的表達情況

與空白組比較，模型組LN、PDGF表達水平明顯升高;與各觀察組比較，觀察組中LN、PDGF表達水平均降低，差別有統計學意義（均P<0.01）;與其他組比較，十棗湯高劑量組LN、PDGF表達水平明顯降低，差別有統計學意義（均P<0.05）;與十棗湯低、中劑量組比較，吡非尼酮組LN表達水平差異均無統計學意義（均P>0.05）;吡非尼酮組與十棗湯中劑量組PDGF表達水平差異無統計學意義（P>0.05）;與十棗湯低劑量組比較，吡非尼酮組PDGF表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與十棗湯低劑量組比較，十棗湯中劑量組PDGF表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3.2 給藥第28天時大鼠肺組織中LN、PDGF的表達情況

與空白組比較，各組LN、PDGF表達水平明顯升高（均P<0.01）;與模型組相較，觀察組中LN、PDGF表達水平均降低，差異有統計學意義（均P<0.01）;與其他觀察組相較，十棗湯高劑量組LN、PDGF表達水平明顯降低，差別有統計學意義（均P<0.05）;吡非尼酮組與十棗湯中劑量組LN、PDGF表達水平差異無統計學意義（均P>0.05）;與十棗湯低劑量組比較，吡非尼酮組LN、PDGF表達水平降低，差異有統計學意義（均P<0.05）;與十棗湯低劑量組比較，十棗湯中劑量組LN、PDGF表達水平降低，差異有統計學意義（均P<0.05）。見表2。

3 討論

特發性肺纖維化是現代醫學間質性肺疾病的范疇，其組織學和（或）胸部HRCT特征性表現為普通型間質性肺炎，病理生理機制為炎細胞滲出、成纖維細胞聚集及膠原等細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）的過多沉積[10]。其中，LN及PDGF介入并介導肺纖維化，在其進展過程中發揮重要作用。LN是細胞基質中的非膠原糖蛋白，主要由肺泡上皮細胞、內皮細胞及某些間質細胞產生，是基膜的主要結構成分[11]，其主要功能是調節細胞黏附、增殖和維持細胞骨架[12]。LN參與內皮細胞的損傷過程，其大量增多能促使炎癥細胞積聚于基底膜，損傷肺組織進而導致肺纖維化[13]。除此之外，LN能促進巨噬細胞和T淋巴細胞分泌淋巴因子，促使成纖維細胞合成膠原，其在肺纖維化發生發展的全過程中發揮了重要作用[14]。PDGF是一種強的間質細胞促有絲分裂素，由巨噬細胞和血小板等細胞分泌。PDGF可引起細胞過度增殖，特別是能刺激成纖維細胞增殖及轉移，促進肌纖維母細胞產生大量膠原蛋白，調節ECM沉積和降解，影響細胞外基質代謝，引起肺部組織纖維化[15]，而其引起的細胞過度增殖能進一步加重肺組織的炎癥反應[16]，加快肺纖維化的進程。本研究顯示，十棗湯能夠有效改善博來霉素誘導小鼠肺纖維化的病理學改變程度，減輕肺組織炎癥活動度，抑制肺組織中LN及PDGF的表達水平，表明了十棗湯具有良好的抗纖維化作用。

中醫學將IPF歸納為肺痿、肺痹的范疇[17]，其主要病機為痰瘀深伏凝結、肺絡痹阻[18]。導師王燕青主任認為，炎癥滲出和結締組織增生是中醫學“痰、瘀”的特征之一，其中頑痰是形成IPF的最根本原因，頑痰深伏，結成窠臼，留而不出，痹阻肺絡，阻滯經脈氣血運行。而氣血運行不暢，久則成瘀，肺臟失養，無力推動氣血運行，血行滯澀，堵塞肺絡亦為瘀血，如此反復，痰瘀互結，肺絡痹阻愈甚。痰飲之邪為患，治療上當以化痰為法，張仲景在《金匱要略》中便已提出“病痰飲者，當以溫藥和之”之明訓[19]，臨床治療中也大多遵循此法。而此病痰飲者，非仲景一般溫藥所能化之。IPF起病急，進展快，預后差，屬“虎狼之病”，而導師從砒霜治療白血病中得到啟示，認為虎狼之病須用虎狼之藥方可平之，必用十棗湯，達水飲窠囊隱僻之處，祛除窠臼之痰飲。方中甘遂擅驅經絡之水飲，大戟擅消臟腑之水飲，芫花能破水飲窠臼，三藥合用峻泄肺中頑痰邪飲，導其水，挫其勢，加用棗湯調服，既健脾扶正，又能緩和峻藥之毒，使峻下而不傷正，四藥相和，使肺絡得通，氣血得以運行，肺臟得以充養，宗氣生成充足，痰、瘀等癥狀均得到一定改善。在十棗湯原文有“……不卒死，至一百日或一歲，宜十棗湯”，體現了此方可用于治療病情危重，生存時間短的疾病，這便與IPF的臨床特點有不謀而合之處。十棗湯既能峻瀉有形之水飲，又能祛無形之邪氣，此峻猛之方能夠直達病所，以導水飲從大腸而出。《黃帝內經·靈樞》中論述“肺合大腸，腸者，傳導之腑”，肺與大腸相表里，腑氣不通則肺氣不降，通過峻瀉大腸之法，給肺中之水飲邪氣以出路，腑氣得通，使肺之宣降功能得以恢復，這正體現了中醫“上病下治”的治療思想[19]。十棗湯為仲景峻下逐水之猛劑，從現代醫學角度來看，其阻斷肺纖維化的發展進程，截斷了疾病進展期的瀑布反應，起到了“截斷扭轉”的作用[20]。

綜上所述，十棗湯能抑制肺組織中LN及PDGF的表達，從而發揮其抗肺纖維化作用，為峻下逐水法干預IPF的臨床推廣應用提供了依據。但基于十棗湯有毒且逐水作用迅猛，臨床研究尚存在不足。

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（2020-01-14收稿 本文編輯：楊覺雄）