基于生物信息學分析CDH6基因在胃癌組織中的表達及臨床意義

孟靜靜 崔 敏 周而樂 李 紅 曹 璋＊

（1.濱州醫學院病理學教研室，山東 濱州 256603；2.濱州市人民醫院小兒科，山東 濱州 256600）

0 引言

鈣粘附素(Cadherin，CDH)是一種跨膜糖蛋白，負責細胞間的粘附和維持正常的組織結構。經典的鈣粘附素是一類通過細胞質結構域與連環蛋白相互作用的粘附分子，包括上皮鈣粘附素、神經鈣粘附素和胎盤鈣粘附素等。研究證實，CDH的異常表達與多種癌癥的發生發展密切相關，如CDH1的表達缺失在上皮間充質轉化和增加腫瘤細胞的遷移和侵襲行為中起著重要的作用；CDH3的過度表達與乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結腸癌和胃癌預后不良之間存在顯著相關性。

K-鈣粘附素（K-Cadherin，CDH6）是鈣粘附素家族的成員之一。最近的研究表明，CDH6在多種癌癥中被異常激活。例如，CDH6在骨肉瘤患者中表達上調，并與骨肉瘤患者的整體生存和不良預后密切相關；CDH6是甲狀腺腫瘤侵襲性的潛在調節因子，在具有間充質特征和侵襲性表型的甲狀腺腫瘤細胞中高表達。CDH6的表達與多種腫瘤的發生發展密切相關，然而其與胃癌發生發展的關系卻未見報道。本研究擬采用多種生物信息學分析技術，對CDH6在胃癌中的表達情況及功能進行分析和預測。

1 材料與方法

1.1 數據下載與整理

本研究分析的所用數據均來自公共數據庫，通過TCGA數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）檢索并下載TCGA-STAD項目下的包含30例正常組織和343例胃癌組織的RNA轉錄本數據，及406例胃癌患者的臨床數據，依據樣本ID標識符，鑒定出25對胃癌組織及與之匹配的癌旁組織樣本。使用R軟件中的“limma”函數包對所有RNA轉錄本數據進行處理。根據樣本ID將臨床數據與RNA轉錄本數據合并。

1.2 不同組間CDH6表達水平對比分析

根據不同臨床參數（如正常組織與腫瘤組織、年齡、性別、組織學分級、臨床分期、TNM分期）進行分組，使用SPSS軟件分析不同組間CDH6的表達水平。

1.3 臨床數據及CDH6表達與預后關系分析

使用R軟件中的“survival”與“survminer”函數包進行單因素和多因素Cox歸分析，評價CDH6及其他臨床參數對胃癌預后的影響，同時進行Kaplan-Meier生存曲線的繪制，分析CDH6高低表達組樣本間總生存期的差異。

1.4 CDH6共表達基因的功能分析

使用cBioPortal平臺（http://www.cbioportal.org/）分析Stomach Adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）數據集中CDH6與其他基因的共表達情況，將|R|≥0.6和P＜0.05作為篩選標準，篩選與CDH6存在共表達關系的基因。使用Metascape（https://metascape.org/）對CDH6及CDH6共表達的基因進行GO和KEGG富集分析，將Min Overlap設置為3，P Value Cutoff設置為0.01，Min Enrichment設置為1.5，推測CDH6在胃癌中的相關功能和途徑。

1.5 CDH6高和低表達組的基因集富集分析(GSEA)

以分子簽名數據庫（MSigDB）中的h（h.all.v7.2.symbols.gmt）作為參考基因集，使用GSEA4.1.0分析CDH6高低表達組樣本間生物功能的差異。FDR＜0.25且P＜0.05作為篩選標準，用于篩選顯著富集的標志基因集。

1.6 CDH6與腫瘤免疫相關性的分析

CIBERSORT是一種使用基因表達數據來估計混合細胞群中免疫細胞組成的分析工具。使用R軟件的“CIBERSORT”函數包評估所有樣本中22種免疫細胞的組分；“reshape2”與“ggpubr”函數包分析正常組織與腫瘤組織間22種免疫細胞組分的差異。利用TIMER在線數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析CDH6與胃癌中多種免疫細胞之間的關系。根據之前相關文獻的研究，利用TIMER在線數據庫分析CDH6與20種潛在靶向免疫檢查點基因之間的關系。

1.7 統計分析

使用R 4.0.2軟件、IBM SPSS Statistics 25.0軟件、GraphPad Prism 8.3.0軟件和Adobe Photoshop CC軟件進行圖表繪制及統計分析。隨訪＜30天且臨床資料未知或不完整的患者被排除在采納數據的標準之外。根據CDH6表達量的中位數將所有樣本分為CDH6高表達組與CDH6低表達組，組間差異采用Student’s t檢驗和Wilcoxon檢驗。單因素分析確定的變量P＜0.05作為多因素Cox分析的候選變量。

丁主任頓了半響，扶起甲洛洛：張大爺，雖然你拿了營業部的東西，但你也是為了救人，將功贖罪，應該不會被判刑。嘎絨有些疑惑地看著丁主任：主任，我們私了不行嗎？報案對誰都沒什么好處。西西一下坐直了身子，看看嘎絨，又看看丁主任：如果可以，營業部丟失的東西我們一起賠。梨花趕緊擦干眼淚：我所有的工資都可以抵賬。

2 結果

2.1 CDH6在胃癌中高表達

通過分析TCGA數據庫下載的樣本數據，與正常組織相比，胃癌組織中CDH6的表達明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0.05），分析比較CDH6的表達與胃癌不同臨床參數的關系，結果顯示，CDH6的表達水平與胃癌的T分期顯著相關（P＜0.05），而與其他臨床病理參數無顯著相關性（P＞0.05）。

2.2 CDH6高表達與胃癌的不良預后相關

通過進行單因素和多因素的Cox回歸分析，單因素Cox回歸結果顯示，CDH6高表達與較差的預后相關（HR=1.362，95%CI:1.110-1.671，P=0.003），調整其他因素后，進行的多因素Cox回歸結果顯示，CDH6的高表達是胃癌不良預后的獨立危險因素（HR=1.405，95%CI:1.126-1.753，P=0.003）。對CDH6高低表達組進行的Kaplan-Meier生存分析顯示，CDH6高表達組胃癌患者的預后較差（P＜0.001）。

2.3 CDH6及共表達基因的富集分析

Metascape對CDH6及與CDH6存在共表達關系的基因進行GO富集分析和KEGG富集分析，主要富集的GO生物過程是血管發育、細胞—基質粘附、與分化有關的細胞形態發生、細胞外基質組織、循環系統過程等；主要富集的GO分子功能是鈣離子結合、細胞外基質結構成分、生長因子結合、肌醇-1，4，5-三磷酸結合、血小板源性生長因子受體結合等；主要富集的GO細胞成分是細胞外基質、細胞間連接、細胞皮層、參與細胞粘附的蛋白質復合物、膜筏等。主要富集的KEGG通路基因集是焦點粘連、cGMP-PKG信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、Rap1信號通路、鈣信號通路等。

2.4 CDH6高表達與上皮間充質轉化相關

通過對CDH6高低表達組進行標志基因集的GSEA分析，結果顯示，主要富集的前五位基因集為上皮間充質轉化、凝血、血管生成、Hedgehog信號、肌細胞發生。

2.5 CDH6與胃癌免疫細胞浸潤正相關

使用“CIBERSORT”對所有樣本進行免疫細胞浸潤的分析。分析結果顯示，與正常組織相比，胃癌組織中M0型巨噬細胞、M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞、幼稚B細胞、活化CD4+記憶T細胞和濾泡輔助T細胞的比例明顯上調（P＜0.05）。TIMER數據庫的分析結果顯示，CDH6的高表達與胃癌中巨噬細胞、CD4+T細胞等多種免疫細胞的上調正相關（P＜0.05）。

3 討論

經典的鈣粘附素是一類通過細胞質結構域與連環蛋白相互作用的黏附分子，包括了很多亞群，經典的鈣粘附素有上皮鈣粘附素、胎盤鈣粘附素和神經鈣粘附素。這些鈣粘附素與多種癌癥的發生發展密切相關。有研究發現，E-鈣粘附素通過限制活性氧介導的凋亡，在乳腺浸潤性導管癌侵襲、轉移過程中發揮著重要作用，E-鈣粘附素表達缺失會導致EMT過程的發生。N-鈣粘附素的異常表達與血管生成、黏附和侵襲等多種腫瘤轉移過程相關。此外，癌癥患者血清中可溶性N-鈣粘附素的表達與預后不良密切相關。

CDH6是一種II型鈣粘附素，是鈣粘附素家族的成員之一。CDH6首先在間充質聚集體和腎囊泡中被檢測到，并發現其可能誘導間充質細胞的早期聚集隨后上皮細胞的轉化，還有研究證實，CDH6在限制性菱形體以及神經板和神經管的其他亞區存在瞬時表達，提示可能在中樞系統的早期發育中發揮作用。近年來，越來越多的研究表明，CDH6的表達與多種腫瘤的發生發展密切相關。在甲狀腺癌中，轉化生長因子β（Transforming Growth Factor Beta 1，TGF-β）可以靶向調控CDH6，使CDH6在具有間充質特征和侵襲性表型的甲狀腺腫瘤中高表達。EBV病毒的感染可以導致CDH6激活，進而誘導鼻咽癌的EMT過程并促進鼻咽癌的侵襲和轉移；CDH6在卵巢癌和腎癌中也存在明顯高表達，CDH6在胃癌中的表達情況及功能尚未報道。

通過對公共數據庫的樣本進行生物信息學分析，可以發現CDH6在胃癌中高表達，其表達的差異影響著胃癌腫瘤的大小及浸潤深度，是胃癌不良預后的獨立危險因素。CDH6及其共表達基因的GO富集分析結果提示，CDH6可能通過影響肌醇-1，4，5-三磷酸結合、細胞-基質粘附等進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移。CDH6及其共表達基因的KEGG通路富集分析結果提示，CDH6可能通過影響焦點粘連、cGMP-PKG信號通路、Rap1信號通路、鈣通道活動、細胞粘附分子功能直接或間接地控制腫瘤細胞的粘附、遷移等活動。雖然GO富集分析顯示CDH6的高表達可能影響細胞遷移的正向調節過程，但CDH6表達與臨床病理參數的分析顯示，CDH6的高表達未顯示出促進胃癌的淋巴轉移及遠處轉移，腫瘤轉移是受多種基因和信號轉導通路的調控的，相關機制還有待進一步研究。

腫瘤的發生發展過程伴隨著長期的、無法消除的炎癥反應，這種反應由局部細胞因子風暴推動。EMT可以使分化的上皮細胞轉化為間充質細胞，在腫瘤的這場局部細胞因子風暴中發揮著重要的作用，影響腫瘤的進展、侵襲和轉移，腫瘤部位的炎性細胞會不斷產生EMT誘導因子，誘發腫瘤細胞的EMT過程。有研究發現，巨噬細胞在實驗中可以通過IL-8依賴的方式誘導肝細胞癌細胞的EMT過程。巨噬細胞還可以通過表皮生長因子誘導非小細胞肺癌細胞EMT過程的發生。此外，大量CD33陽性髓系細胞浸潤的三陰性乳腺癌更容易出現EMT征象。在本研究中，筆者試圖探究胃癌中CDH6與EMT和免疫細胞之間的關系。GSEA富集分析的結果顯示，CDH6高表達組主要富集的標志基因集有EMT和Hedgehog信號等。有研究證實，Hedgehog信號參與調控EMT過程，促進胃癌細胞的侵襲和遷移能力。CDH6可能通過促進胃癌的EMT過程來影響胃癌的進展與預后。本研究觀察到CDH6的高表達與胃癌中巨噬細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的上調存在相關性，其中相關系數最高的是巨噬細胞。結合CDH6與CD68、CD163共表達關系的結果與免疫細胞浸潤分析的結果，巨噬細胞在胃癌中上調，并且以M2型巨噬細胞上調為主。之前的研究證明，腫瘤浸潤巨噬細胞（TAMs）中M2型巨噬細胞會促進細胞外基質重構、血管生成、免疫抑制，并通過分泌各種可溶性因子促進癌細胞獲得侵襲特性。在許多獨立研究中，TAMs被描述為有效的EMT誘導劑，TAM相應地產生多種生長因子，進而誘導腫瘤細胞EMT過程的發生，而M2型巨噬細胞與腫瘤細胞共培養實驗證實其促進腫瘤細胞獲得EMT的能力。由此推測，在胃癌中CDH6可能被TAMs產生的TGF-β等因子靶向上調，進而促進了胃癌細胞的EMT過程，最終影響胃癌的進展與預后。

本研究中，胃癌中CDH6的高表達與PDL2、TGFβ、HAVCR2和TNFSF4等多個常見免疫檢查點和免疫相關用藥靶點的高表達存在正相關關系。在多種腫瘤中，EMT評分與免疫檢查點基因的表達呈高度正相關。因此，CDH6可能成為預測胃癌免疫治療應答率的潛在靶標基因，為胃癌患者從免疫治療中更好地獲益。

在本研究中CDH6在胃癌中呈高表達狀態，增加了胃癌細胞的侵襲性，筆者推測CDH6可能被TGF-β等因子調控進而通過EMT過程來影響胃癌的進展與預后，CDH6的表達還與多個免疫相關靶點相關。以上結果是根據生物信息學分析結果推測的結論，還需通過體內體外實驗來對結論進行驗證。綜合本研究結果，針對CDH6表達情況對胃癌患者選擇個性化的免疫治療或研發靶向沉默CDH6的藥物，都可能為胃癌的治療提供新思路。