紅桿天麻共生蜜環菌篩選初探

李曉東, 雷 萍, 付玉平, 蒙 琳,張羽翅,王詠梅,楊 楊,敬 丹

(1.陜西省略陽縣中藥材技術推廣服務中心，陜西 略陽 724300；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

蜜環菌(Armillariamellea)屬擔子菌綱，白蘑科、蜜環菌屬兼寄生性真菌，除本身能作為藥用外，它常常與名貴中藥材天麻、豬苓共生，為其提供營養。蜜環菌具有生態、物種、遺傳、形態多樣性[1]，不同的地理區域分布著不同種類的蜜環菌[2]。陜西略陽秦嶺南麓，由三個中山區和三個淺山區構成，最高海拔2 425 m，最低海拔587 m，年平均降雨量達826.2 mm[3]，良好的地理氣候環境孕育豐富野生蜜環菌資源。目前種植最廣、最多的是紅桿天麻，而與之共生蜜環菌因繁育多代，已出現嚴重退化現象。蜜環菌多代應用會出現明顯的菌種退化與變異[4]；生產中常用老化的天麻栽培菌材反復轉接，菌種嚴重退化，菌索長勢衰退[5]。實踐表明，蜜環菌多代繁殖后，其侵染菌棒皮內菌絲發黃、變暗；菌索分支變少、顏色呈黑褐色，不發紅，頂部無白色的生長點，菌索呈空殼狀，髓心疏松菌絲極少，用手輕拉，便斷裂，表現出嚴重的退化現象。為此，筆者進行野生蜜環菌菌株采集、分離篩選研究，以期為紅桿天麻共生蜜環菌篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

51個與野生天麻共生的野生蜜環菌菌索樣、蜜環菌A9(對照)。櫟樹木材(青岡)、珍珠巖、樹葉，PDA固態培養基，培養皿，250 mL錐形瓶。

1.2 試驗方法

1.2.1 選擇優株 將樣材料帶回后，分別與500 g櫟樹木材(青岡)和500 g干凈濕潤的青岡樹葉混合，在同一環境室內種入珍珠巖中進行培養，20 d。將菌索生長快、無腐爛、無霉菌，性狀優良的菌索生長點為首選材料(菌株)。

1.2.2 優選分離菌株培養 在超凈工作臺，用尖頭鑷子取優選分離的蜜環菌菌株菌索白嫩生長點0.5～1 cm左右，用無菌水沖洗后，尖端朝下豎直插入PDA培養基內，25℃培養箱中黑暗培養，獲取菌絲體后，再擴大培育。

1.2.3 優選菌株分子生物學鑒定 委托陜西理工大學生物學院實驗室將優選分離擴大培育的菌株及對照菌株(A9)再進行培養皿活化培養后，用蜜環菌菌株按照基因組瓊脂糖凝膠電泳驗證、PCR擴增18S rRNA序列 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳驗證；將條帶切割，分別合并，進行PCR膠回收，具體操作步驟參照天根生化科技有限公司《DNA純化回收試劑盒》，送交測序公司測序，分析軟件MEGA4.0，構建進化樹，對測序結果進行分析。

1.2.4 蜜環菌伴栽天麻試驗 按照《略陽縣天麻栽培技術》統一規范技術，在海拔600～1 420 m區域八個村進行蜜環菌L1、L2、L3、L4、A9與天麻蒴果伴栽試驗。每個菌株隨機抽查3窩，每窩翻3根菌棒。種植2個月后觀察菌索、天麻種子生長情況。

2 結果與分析

2.1 野生蜜環菌優選結果

在不同海拔有豐富櫟類殼斗科植物生長的地區采集51個蜜環菌菌株，共獲得4株優良蜜環菌菌株，分別為L1(西淮壩楊樹峁，海拔1 264.1 m)；L2(甘肅陽壩，海拔1 104 m)；L3(郭鎮灣里，海拔1 172.8 m)；L4(五龍洞，海拔951.6 m)。

表1 優良野生蜜環菌采集位置

由此可見，優良野生蜜環菌生長地在海拔900～1 300 m。陜西略陽具有典型的秦巴山地特征，又是我國天麻傳統產區，具有豐富的野生蜜環菌資源，可以認為該地區是優良野生蜜環菌自然生長分布區域之一。

2.2 優選蜜環菌菌株三級種培養結果

由陜西略陽縣鴻福菌種廠，將試管轉入已制作好的母種培養基上培養，然后轉接培養三級種。結果見表2。

表2 優選蜜環菌菌株三級種培養結果

由表2 可知，L1、L3、L4蜜環菌菌株生長表現各不相同，顏色均比較好、相比較菌絲長、生長優良。

2.3 分子生物學鑒定結果

所選菌株分別送陜西微生物研究所、陜西理工大學分別鑒定，結果顯示相似度由低到高是L3菌屬于Armillaria(蜜環菌屬)，與Armillariagallica較為接近，相似度97%;L4菌屬于Armillaria(蜜環菌屬)，與Armillariagallica接近，相似度97%；L1菌屬于Armillaria(蜜環菌屬)，與Armillariagallica接近，相似度99%；可以認為A9、L1、L2和L4均為蜜環菌。

經過對5種蜜環菌的培養，其中L1、L3與L4進行了培養皿活化培養，以及液體培養。由于母種污染，L2和A9沒擴大培養。L1、L3與L4的培養皿活化培養，顯示蜜環菌活力大小由高到底為：L1>L3>L4(圖1)。

L1蜜環菌 L3蜜環菌 L4蜜環菌

2.4 伴栽天麻試驗結果

篩選獲得蜜環菌菌株與A9(對照)菌索外殼都呈現較厚而菌索皮層較薄，中腔充滿濃密的疏松菌絲，生命力旺盛。在土壤缺水偏干的環境中，L1長勢較好，抗旱能力強，菌絲粗狀；其次是L4，L2、L3；在海拔600～1 420 m,L1、L2、L3號表現長勢旺盛；A9號(對照)在各試驗點缺水偏干的環境中長勢弱，但在水分充足條件下，其生命力旺盛，分枝多，菌絲略細；L4、A9蜜環菌顏色紅褐色稍偏紅為主，L1、L2、L3菌索顏色稍深些紅棕色或褐色為主。從天麻萌發情況看(表3、續表3)，L1、L3、L4、A9(對照)在1 000 m海拔以下的長壩、仙臺壩、兩流水、跑馬村、明水壩、葦子溝等幾處萌發好，接菌快，后期整體天麻產量都好。有可能這些地區溫度適宜，對天麻生長有很大促進作用。

表3 優選蜜環菌大田伴栽天麻試驗結果

2.5 子實體培養提取純菌絲結果

將蜜環菌母種活化、擴大培養后，進行蜜環菌子實體誘導(圖2)。在黑暗培養獲得的蜜環菌至于恒溫光照培養箱中，設置條件：18℃，晝夜交替培養，光照強度為60%，水分設置為95%。注意保持水分潮濕環境。觀察出菇情況。L1、L3子實體誘導取得成功，但沒有獲得有效蜜環菌純菌絲。后期還需繼續培養子實體產生的孢子作為種源，然后進行分離培養出純的菌絲體，今后，應加強保種和子實體培養提取純菌絲工作，以減緩多代繁育退化的速度。

蜜環菌的活化

3 小結與討論

蜜環菌是天麻供給營養的載體，野生資源有一定的分布范圍，其活力直接影響天麻的產量，目前從野生天麻變型與伴生蜜環菌分布看，不同天麻種、變型對蜜環菌是有區別的，陜西略陽紅桿天麻多分布在海拔900～1 300 m，烏桿天麻多分布在海拔1 500～2 000 m，是否存在不同變型天麻生長對蜜環菌需求不同，國內尚未有此報道，后期還需要進一步研究。同時，在科學采集野生蜜環菌資源時，建議根據其蜜環菌生境，采取自然保存，減少人工保存成本，恢復抗性，以保護蜜環菌資源，實現可持續利用。