不同氣候因素對(duì)延胡索中8種生物堿含量的影響

張 桐，李 凱，曹曉燕,原軍寧，黃亞亞

(1.陜西師范大學(xué)，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室/藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710062；2.陜西白云制藥有限公司，陜西 漢中 723200)

中藥延胡索(CorydalisRhizoma)又名元胡，來源于罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，其功能主治為“活血、行氣、止痛”，為中醫(yī)臨床理氣止痛之要藥，用于治療胸脅、脘腹疼痛、胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻、跌撲腫痛等[1〗。延胡索與白術(shù)、白芍、浙貝母、杭白菊、玄參、筧麥冬、溫郁金并稱為“浙八味”[2]。延胡索的主要活性成分為生物堿類物質(zhì)，尤其是叔氨堿和季氨堿類物質(zhì)[3]，其中原阿片堿具有抗肝纖維化的作用[4]，鹽酸巴馬汀具有抗胃腸潰瘍的作用[5]，脫氫紫堇堿能夠治療糖尿病心肌纖維化[6]，海罌粟堿可以降低癌細(xì)胞的多藥耐藥性，提高對(duì)癌細(xì)胞的化療效能[7]，四氫小檗堿具有抗炎作用[8]，延胡索甲素和延胡索乙素具有鎮(zhèn)靜催眠、降血壓以及鈣拮抗作用[9～10]。而在2020版《中國藥典》規(guī)定的延胡索含量測(cè)定檢測(cè)項(xiàng)下，僅以延胡索乙素的含量作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)[1]，無法實(shí)現(xiàn)全面客觀控制藥材質(zhì)量，因此筆者研究中采用了多指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

延胡索的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)為浙江省東陽、磐安等地區(qū)[11]，從20世紀(jì)九十年代開始，延胡索的種植產(chǎn)地逐漸從浙江沿海地區(qū)遷移到陜西、安徽和湖北等地，其中陜西逐漸發(fā)展為延胡索的主產(chǎn)區(qū)。不同的環(huán)境(尤其是氣候因子)決定著中藥材中的指標(biāo)成分的高低，例如溫度、濕度、光照等氣候條件，都是影響藥用植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，對(duì)植物的自然分布以及適應(yīng)性起著決定性左右[12～13]。筆者研究在對(duì)浙江和陜西等地的延胡索進(jìn)行調(diào)查、收集的基礎(chǔ)上，對(duì)來自13個(gè)采集地點(diǎn)的延胡索藥材中8種生物堿成分進(jìn)行含量測(cè)定，并結(jié)合收集到的產(chǎn)地相關(guān)氣候因子進(jìn)行相關(guān)性分析，探究氣候因子對(duì)延胡索藥材中生物堿含量的影響，為進(jìn)一步指導(dǎo)延胡索最適宜的種植條件，從而提高藥材的整體質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli 2Q 超純水儀(Millipore公司)；Agilent 5 TC-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱(美國Agilent)。

1.2 材料及試劑

延胡索新鮮的塊莖于2019年5月采集于陜西省和浙江省的13個(gè)地點(diǎn)，具體地址見表1。收集后洗凈泥土，置于50℃烘箱下烘干，粉碎過80目篩。所用對(duì)照品的相關(guān)信息見表2，乙腈、甲醇均為色譜純，購自美國Fisher公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

表1 2019年延胡索藥材采集地點(diǎn)及時(shí)間

表2 實(shí)驗(yàn)所用對(duì)照品相關(guān)信息

文中所涉及到的延胡索13個(gè)采集點(diǎn)歸屬于8個(gè)產(chǎn)地，8個(gè)產(chǎn)地的相關(guān)氣候因子信息均是從中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)(http://data.cma.cn/)申請(qǐng)獲得，具體信息見表3。

表3 氣候因子統(tǒng)計(jì)

2 方法

2.1 色譜條件[2]

采用Agilent 5 TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈、流動(dòng)相B為0.1%的磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH為6.0)，梯度洗脫(0～15 min，20%A；15～35 min，20%～80%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量為10 μL。上述色譜條件下，各組分分離度好，色譜圖見圖1。

1-原阿片堿；2-鹽酸巴馬汀；3-鹽酸小檗堿；4-脫氫紫堇堿；5-海罌粟堿；6-延胡索乙素；7-四氫小檗堿；8-延胡索甲素

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定原阿片堿5.24 mg、鹽酸巴馬汀5.18 mg、鹽酸小檗堿5.16 mg、脫氫紫堇堿5.06 mg、海罌粟堿1.13 mg、延胡索乙素4.60 mg、四氫小檗堿5.11 mg、延胡索甲素5.14 mg，一起混和加入到10 mL的容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，即得混標(biāo)溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 取延胡索藥材，粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，精密稱取0.5 g，加入到圓底燒瓶里，加入濃氨試液-甲醇(1∶20)的混合溶液50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷后，再次稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過。精密量取濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移到5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 樣品含量測(cè)定

取13個(gè)采集地的延胡索樣品適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定，采用“外標(biāo)法”通過記錄峰面積計(jì)算各生物堿成分的含量，并使用SPSS 22.0軟件中的ANOVA分析，對(duì)不同產(chǎn)地的同一生物堿含量進(jìn)行差異顯著性分析。

2.4 相關(guān)性分析

采用SPSS 22.0軟件分析中的雙變量分析(Spearman相關(guān)系數(shù)，雙尾檢驗(yàn))分析各產(chǎn)地延胡索中8種生物堿含量與不同的氣候因子的相關(guān)性。當(dāng)P<0.01時(shí)，表面兩者之間存在極顯著相關(guān)；當(dāng)P<0.05時(shí)，表面兩者之間存在顯著相關(guān)；反之，則不相關(guān)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地延胡索中生物堿含量測(cè)定結(jié)果

采用“2”中的高效液相色譜方法，對(duì)13個(gè)采集地區(qū)的延胡索藥材進(jìn)行含量測(cè)定，并利用SPSS 22.0軟件中的ANOVA分析進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果如表5所示。測(cè)定結(jié)果顯示，在13個(gè)產(chǎn)地的樣品中，脫氫紫堇堿在所測(cè)的8種生物堿中含量均為最高，而四氫小檗堿的含量均為最低。陜西的8個(gè)產(chǎn)地(編號(hào)1～8)中，除了海罌粟堿和四氫小檗堿在個(gè)別產(chǎn)地間存在顯著差異外，其余6種生物堿含量在陜西的8個(gè)產(chǎn)地之間均沒有顯著性差異；浙江的5個(gè)產(chǎn)地(編號(hào)9～13)中，同一種生物堿含量在5個(gè)產(chǎn)地之間均不存在顯著性差異；除了鹽酸巴馬汀以外，其余7種生物堿含量在陜西和浙江的樣品之間均存在顯著性差異，其中陜西8個(gè)產(chǎn)地的樣品中海罌粟堿的含量均顯著高于浙江產(chǎn)地樣品。

表4 不同產(chǎn)地延胡索生物堿含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3.2 不同氣候因子與各生物堿成分之間的相關(guān)性分析

研究中采用SPSS 22.0軟件分析中的雙變量分析(Spearman相關(guān)系數(shù)，雙尾檢驗(yàn))對(duì)年均氣溫、1月份平均氣溫、7月份平均氣溫、年均降水量、年均日照時(shí)長(zhǎng)、年均相對(duì)濕度、經(jīng)度、緯度、海拔與各生物堿含量進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果如表5顯示，年均相對(duì)濕度和生物堿的含量之間不存在相關(guān)性，即年均相對(duì)濕度不影響這8種生物堿的合成和積累；年均氣溫和原阿片堿、脫氫紫堇堿和四氫小檗堿存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，1月份平均氣溫和脫氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素及四氫小檗堿存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，7月份平均氣溫和脫氫紫堇堿、海罌粟堿及延胡索甲素存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，即氣溫越低，原阿片堿、脫氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素及四氫小檗堿的含量積累越多；年均降水量和鹽酸小檗堿及延胡索乙素存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，和脫氫紫堇堿、海罌粟堿及延胡索甲素存在極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，即低降水量有利于脫氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素、鹽酸小檗堿及延胡索乙素的積累；年均日照時(shí)長(zhǎng)和原阿片堿、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿及延胡索乙素存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，和海罌粟堿之間存在極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，即長(zhǎng)時(shí)間的日照會(huì)使原阿片堿、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素及海罌粟堿的積累變少；海拔高度和鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿及延胡索乙素存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，和海罌粟堿存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，即高海拔可促進(jìn)鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿、延胡索乙素及海罌粟堿的積累。綜上，除了鹽酸巴馬汀，其他生物堿的積累均與氣候因子之間存在一定的相關(guān)性；除了年均相對(duì)濕度以外，其他環(huán)境因子均與脫氫紫堇堿含量之間存在相關(guān)性，即脫氫紫堇堿的積累更容易受到環(huán)境因素的控制。

表5 氣候因子與各生物堿含量的相關(guān)性分析

4 討論

目前關(guān)于不同產(chǎn)地延胡索中生物堿類成分含量的測(cè)定及分析已有相關(guān)報(bào)道，如，張穎等[14]分析測(cè)定了全國各產(chǎn)地的21批延胡索藥材中原阿片堿、去氫紫堇堿及延胡索乙素的含量；張靜等[15]采用HPLC同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地、不同商品等級(jí)的延胡索藥材中原阿片堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、脫氫紫堇堿和延胡索乙素等6種生物堿的含量。實(shí)驗(yàn)室前期建立了同時(shí)測(cè)定延胡索藥材中8種生物堿含量的高效液相色譜法[2]，能夠在35 min之內(nèi)完成出峰，耗時(shí)較短，大大節(jié)省了試劑消耗和時(shí)間成本，因此筆者研究利用該方法對(duì)不同產(chǎn)地延胡索藥材中的8種生物堿含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，以期更全面、更客觀地分析不同產(chǎn)地延胡索藥材的質(zhì)量。

藥材的質(zhì)量往往與其所處環(huán)境的氣候密切相關(guān)，氣候因子會(huì)通過影響藥材的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而影響藥材中次生代謝產(chǎn)物的積累，而藥材中大多數(shù)有效成分是其次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，不同產(chǎn)地的藥材會(huì)因?yàn)闅夂蛞蛩氐牟煌溆行С煞值暮坎町愶@著。研究首次分析了不同氣候因子與各生物堿含量的相關(guān)性，結(jié)果顯示，低氣溫、低降水量、短日照時(shí)間及高海拔環(huán)境更適宜延胡索藥材中生物堿的合成與積累，陜西地區(qū)的氣候環(huán)境較浙江地區(qū)更適宜延胡索藥材中生物堿含量的積累，推測(cè)這也是導(dǎo)致延胡索的主產(chǎn)區(qū)由之前的浙江磐安等地向陜西漢中地區(qū)轉(zhuǎn)移的原因之一。目前，陜西地區(qū)所產(chǎn)的延胡索占全國市場(chǎng)的70%左右。

關(guān)于影響延胡索藥材生物堿含量的因素已有相關(guān)研究報(bào)道，如，徐珂等[16]研究分析了土壤養(yǎng)分和延胡索品質(zhì)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)延胡索乙素的含量與土壤中速效K成顯著性正相關(guān)；徐雪琴等[17]調(diào)查分析了不同產(chǎn)地的延胡索采收時(shí)間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然延胡索的采收時(shí)間集中在5月份，但是由于南北氣候的差異以及栽培面積的不同，完成采集時(shí)間不完全一致，并且存在拖后或提前采收的情況；楊陽等[18]研究分析了延胡索中延胡索乙素的含量與延胡索塊莖內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)木霉屬內(nèi)生真菌T83與延胡索乙素含量呈正相關(guān)。這些表明氣候差異只是導(dǎo)致延胡索中生物堿含量差異的原因之一。就延胡索乙素這一指標(biāo)成分來說，研究所測(cè)浙江地區(qū)延胡索中的延胡索乙素含量范圍為0.80～1.21 mg/g，陜西地區(qū)的含量范圍為0.99～1.68 mg/g，即陜西樣品中延胡索乙素的含量整體高于浙江。有相關(guān)研究報(bào)道[19]所測(cè)的浙江磐安地區(qū)延胡索藥材中的延胡索乙素含量為1.61 mg/g，大于筆者研究中所測(cè)的數(shù)值，推測(cè)其可能是采收當(dāng)年的氣候因素差異所導(dǎo)致的。

研究初步采用相關(guān)性分析的方法，研究不同的氣候因子對(duì)于延胡索藥材中生物堿含量的影響，最后得出低氣溫、低降水量、短日照時(shí)間及高海拔環(huán)境更適宜延胡索藥材中部分生物堿的合成與積累，進(jìn)而推測(cè)氣候因素是導(dǎo)致延胡索的主產(chǎn)區(qū)從浙江磐安等地區(qū)向陜西漢中地區(qū)轉(zhuǎn)移的原因之一，可為今后全面評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地延胡索藥材品質(zhì)提供有價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)。