響應面法優化商洛百合多糖的提取工藝研究

高 潔，武曉磊，孔 爽，王 瑩

(1.陜西國際商貿學院 醫藥學院，陜西 咸陽 712000;2.陜西省中藥綠色制造技術協同創新中心，陜西 咸陽 712000)

百合，為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的干燥肉質鱗葉[1]。百合作為國家首批批準通過的藥食兩用植物，不僅作為保健食品，而且還具有很高的藥用價值[2,3]。百合中含有皂苷，多糖，生物堿，蛋白質，多種維生素、微量元素等成分，具有養陰、滋陰、潤肺，清心安神的功效[4]。

百合多糖是一種混合多糖，現代醫學在對百合的研究過程中發現百合多糖是百合中的主要功能成分之一，具有潤肺止咳，抗氧化，提高免疫力，抗腫瘤等作用[5,6]。目前國內提取百合多糖常用的方法有：微波輔助提取法、水提法、超聲波提取法、酶法，溶劑法等[7～9]。水提法具有較多優點，因此仍作為百合多糖的主要提取方法，但水提法提取百合多糖的響應面優化報道較為少見，筆者對水提法提取百合多糖進行響應面工藝優化進，旨在提高百合多糖的提取率，為百合的藥食應用開發提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮百合(購于商洛百合種植戶，經陜西中醫藥大學雷國蓮教授鑒定為百合)；D-無水葡萄糖標準品(中國藥品生物制品鑒定所)；試驗所用化學試劑均為分析純。

1.2 實驗設備

分析天平；可見分光光度計；低速離心機；高速粉碎機；電熱恒溫鼓風干燥箱；旋轉蒸發儀；循環式多用真空泵；數顯恒溫水浴鍋。

1.3 提取工藝路線

干燥百合→粉碎→回流→離心→濃縮→除蛋白→含量測定

1.4 試驗方法

1.4.1 標準曲線制備 稱取葡萄糖標準品10 mg，加水溶解后定容至100 mL，稀釋至不同濃度于容量瓶中標，再分別精確吸取1.0 mL到試管內，加入5 %苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，室溫條件下靜置40 min，同時取1.0 mL蒸餾水、1.0 mL苯酚溶液、5 mL濃硫酸溶液，搖勻混合作為空白組，將不同濃度標準液及空白液在波長490 nm處，測其吸光度A，并且繪制標準取消，并得出線性回歸方程：Y=3.6944X+0.1879，R2=0.9991

1.4.2 百合多糖的提取 供試品制備：取5 g百合粉末置于50 mL圓底燒瓶中，加入水,回流提取4 h，冷卻，離心分離，濃縮到原體積的1/3，加入95%乙醇醇沉后，復溶，加入sevag(氯仿∶正丁醇=1∶4)試劑反復多次去除蛋白，將所得百合多糖溶解后于490 nm處測其吸光度，計算百合多糖含量。

多糖提取率:提取率(%)=(樣品多糖含量×稀釋倍數)/樣品干重×100%

1.4.3 單因素試驗 單因素試驗以百合多糖提取率作為主要考核指標，采用1.4.2的提取方法，選擇液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL/g)，提取時間(1h、2h、3h、4h、5h)，提取溫度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)三個因素進行單因素試驗，考察最佳提取水平范圍。

1.4.4 響應面優化試驗 通過對于單因素試驗結果的考察，以提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)作為響應面試驗的自變量，百合多糖提取率為因變量，通過響應面軟件進行試驗組別的設計，見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素

2.1.1 提取溫度對百合多糖提取率的影響 如圖1所示：回流溫度與百合多糖的提取率所呈現出先正比后反比的趨勢走向，反應的初始階段百合多糖的提取率伴隨著溫度的增大而增大，當提取溫度達到60 ℃時，百合多糖的提取率最大。溫度較低時無法使多糖更好的提取出來，但溫度過高多糖糖苷鍵易發生斷裂，從而使提取率下降。

圖1 提取溫度對百合多糖提取率的影響

2.1.2 液料比對百合多糖的影響 如圖2所示：當液料比小于20∶1 mL/g時，百合多糖的提取率與液料比成正比，在20∶1 mL/g處達到最佳提取率，再升高液料比時，提取率明顯下降。液料比較小原料提取不充分，但是隨著液料比的提升會導致藥液體積增大，提取速率逐漸變慢，提取的效果會較差。

圖2 液料比對百合中百合多糖提取率的影響

2.1.3 提取時間對百合多糖提取率的影響 圖3可知當提取時間為3 h時，提取率達到最大值。當提取時間較小時，百合提取液還未達到適合溫度，并且液料相互作用不充分，因此多糖提取率較低。但隨著時間的眼饞，藥液內部溫度過高使百合多糖結構變性，活性降低，提取效果變差。

圖3 提取時間對百合中百合多糖提取率的影響

2.2 響應面法優化工藝條件

選定提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)3個因素為影響因素，根據單因素試驗確定的水平桿位，結合百合多糖的提取率，進行響應面提取工藝優化，結果如表2，表3所示。

表2 響應面試驗結果

表3 回歸統計分析結果

多元回歸方程為：

Y=26.40+0.075X1+0.20X2+0.14X3+5.000E-003X1X2+0.030X1X3-0.45X2X3-0.35X12-0.31X22-0.31X32

由表3可知，模型極顯著(p<0.001)，失擬項不顯著(p=0.0887>0.05)，說明這個模型的擬合情況較好，并且誤差小，所以此模型可用。

通過表3的方差分析表又可以看出，X2(液料比)、X3(提取時間)、X12、X22、X32都是極顯著的(P<0.01)，而X1(提取溫度)為顯著，所以各因素交互作用是不顯著，并且對響應值百合多糖的提取率影響的顯著性分析后順序為：液料比(X2)>提取時間(X3)>提取溫度(X1)。

2.2.1 響應面結果分析 由圖4可看出，根據液料比的曲線陡峭幅度較大，提取溫度的曲線變化幅度是較小，所以液料比對多糖提取率的影響還是較提取溫度顯著，但是它的交互作用曲面還是較為陡峭，因此二者具有一定的交互作用。

a b

圖5為固定液料比后提取溫度和提取時間兩者相互影響的趨勢圖，從圖中可以看出提取時間的曲線較提取溫度的曲線陡峭，所以得到提取時間的影響較提取溫度的影響顯著，二者的交互作用的顯著性較低。

a b

a b

由圖6可看出，固定多糖的提取溫度，多糖的提取率會伴隨著提取時間和液料比的增加而先上升后下降，從曲面圖可看出液料比曲線較提取時間陡峭，因此液料比對百合多糖提取率的影響較提取時間顯著。

2.2.2 驗證試驗 利用響應面設計軟件得出的最佳工藝條件：提取溫度為60.24 ℃，液料比為23.71∶1 mL/g，提取時間為3.21 h，百合多糖在該工藝條件下提取率可達26.444 %。

考慮降低能耗及實驗的便捷性，將優化條件調整為：提取溫度60 ℃，液料比20∶1 mL/g，提取時間為3 h，并且再進行3次平行實驗，最后得到百合多糖的平均提取率為26.131 %，這個值和預測值的比較相對誤差較小，所以說明這個模型的實用性較好。

3 結論

百合多糖具有廣泛藥理活性，如免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑菌等生物活性，具有較高研究價值。百合多糖的含量高低的影響因素較多，如品種、種植方法，產地、采收期及提取方法，檢測方法等。研究選用水提取法為百合多糖的提取方法，水提法具有耗能源低、所需設備簡單、造價低、體積小、實驗室操作方便等特點，試驗通過響應面來優化水提百合多糖的工藝條件最佳工藝條件得出：提取溫度為60 ℃，液料比為20∶1 mL/g，提取時間為3 h時，最后百合多糖的提取率的最大值為26.131 %。通過對百合多糖的提取更加深入的了解百合多糖在現代醫學臨床中的應用，不斷加深對作用機制的了解，為以后植物多糖的研究發展提供基礎。