復(fù)合精油與有機(jī)酸的抑菌效果和協(xié)同作用研究

張 悻，謝志恒，張瑞雪，顧萬(wàn)軍，周淑貞*

（1.佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，廣東佛山 528234；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225）

隨著現(xiàn)代集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖模式的興起，加上季節(jié)性、地域性環(huán)境條件的變化，使得畜禽易患各種疾病，但化學(xué)類抗菌藥物普遍存在易產(chǎn)生耐藥性、易發(fā)生藥物殘留、副作用大、治療費(fèi)用高、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。因此，尋找副作用小、性價(jià)比高、無(wú)藥物殘留的替代品受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。植物精油因其天然和安全等特性被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥農(nóng)業(yè)和畜牧等行業(yè)（王宏山，2021；Ni等，2021）。研究表明，植物精油具有廣譜高效的抗菌活性，在畜禽生產(chǎn)中添加植物精油有提高生產(chǎn)性能、增強(qiáng)免疫力、改善動(dòng)物腸道、改善肉品質(zhì)等作用（徐慧君等，2021；左春生等，2020）。

本試驗(yàn)比較不同植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的抑菌效果，篩選出抑菌效果較好的幾種植物精油，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出最佳的精油復(fù)合配方，并與酸聯(lián)用，為精油與酸協(xié)同作用于動(dòng)物生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 植物精油：迷迭香精油、桉葉油、大蒜油、薄荷油、肉桂醛、百里香酚、牛至油、香芹酚和薄荷腦購(gòu)自吉安市國(guó)光香料廠；檸檬油、艾葉油、檸檬香茅草油、生姜油、薰衣草油、乳香油購(gòu)自江西雪松天然藥用油有限公司。

有機(jī)酸：乳酸、甲酸、丙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和乙酸均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 試驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基 抑菌試驗(yàn)指示菌：金黃葡萄球菌（ATCC 29213）購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；乙型溶血性鏈球菌來(lái)自佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院贈(zèng)送。

LB固體培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、腦-心浸出液肉湯（BHI）和BHI固體培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 15種植物精油的抑菌試驗(yàn) 采用濾紙片法測(cè)定精油的抑菌效果。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的LB固體培養(yǎng)基和BHI固體培養(yǎng)基倒入空培養(yǎng)皿中15～20 mL。待冷卻凝固后，取指示菌（1×106CFU/mL）0.1 mL于培養(yǎng)基上，涂布均勻，將無(wú)菌濾紙片貼在含菌平板上，在每個(gè)濾紙片中間滴加10 μL精油，同時(shí)，設(shè)置1個(gè)無(wú)精油處理的空白對(duì)照。待精油被濾紙片充分吸收后，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)并放入37℃生化培養(yǎng)箱中，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.2 復(fù)合精油的抑菌試驗(yàn) 選取上述1.2.1中試驗(yàn)效果最好的3種植物精油進(jìn)行試驗(yàn)。將3種精油按照1：1、1：2和2：1的比例進(jìn)行兩兩組合，參照1.2.1進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.3 6種有機(jī)酸的抑菌試驗(yàn) 采用瓊脂打孔法測(cè)定有機(jī)酸的抑菌效果。于超凈工作臺(tái)內(nèi)，在50℃左右的培養(yǎng)基中加入500 μL/100 mL的指示菌（1×106CFU/mL），搖均后倒入空培養(yǎng)皿。用孔徑6 mm的不銹鋼瓊脂打孔器在平板上均勻打上 7個(gè)小孔，在背面分別標(biāo)注空白，1、2、3、4、5、6分別為乳酸、甲酸、丙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸和乙酸，吸取各有機(jī)酸（50%）10 μL，點(diǎn)加到對(duì)應(yīng)瓊脂孔中，置于4℃冰箱中靜置6 h。倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4 復(fù)合精油與有機(jī)酸復(fù)合的抑菌試驗(yàn) 分別選取上述1.2.2和1.2.3中試驗(yàn)效果最好的復(fù)合精油和有機(jī)酸進(jìn)行試驗(yàn)。將復(fù)合精油和有機(jī)酸按照1：1、1：2和2：1的比例進(jìn)行組合，參照1.2.1進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 選取上述試驗(yàn)效果最好的單一精油和復(fù)合精油進(jìn)行試驗(yàn)。最低抑菌濃度MIC的測(cè)定采用試管二倍稀釋法。

2 結(jié)果與分析

2.1 15種植物精油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，15種植物精油對(duì)兩種指示菌的抑菌效果各不相同，其中肉桂醛、香芹酚和牛至油的抑菌效果最好，對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌極為敏感，效果依次為肉桂醛＞香芹酚＞牛至油。

表1 15種植物精油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同比例精油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，肉桂醛與牛至油組合有協(xié)同作用，且比例為2：1時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為22.38和31.16 mm。

表2 不同比例精油的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 6種有機(jī)酸的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表3可知，6種有機(jī)酸中，50%甲酸對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為31和39.01 mm。

表3 6種有機(jī)酸的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.4 復(fù)合精油與有機(jī)酸復(fù)合的抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，復(fù)合精油與酸有協(xié)同作用，其中復(fù)合精油為肉桂醛與牛至油2：1，復(fù)合精油：甲酸為1：1時(shí)效果最好，抑菌圈直徑分別為36.01和37.21 mm。

表4 復(fù)合精油+有機(jī)酸組合抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.5 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果 由表5可知，肉桂醛和牛至油對(duì)金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.3125 mg/mL；對(duì)溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度為0.625 mg/mL；肉桂醛與牛至油比例為2：1時(shí)，其對(duì)金黃葡萄球菌和溶血性鏈球菌最小抑菌濃度分別為0.078125和0.3125 mg/mL。

表5 最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

3 討論

植物精油因其來(lái)自于天然植物，又具有廣譜的抑菌活性，受到廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者研究表明，肉桂、牛至、百里香酚、香茅、山蒼子、丁香、迷迭香和大蒜精油等植物精油具有強(qiáng)抗菌性和抗生物膜活性，且與其化學(xué)成分、提取方式等密切相關(guān)（Huang等，2021；Ben等，2020；王康莉等，2019；李文茹等，2013）。本研究結(jié)果表明，同種精油對(duì)不同病源菌的抑制效果不同，如大蒜油，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果一般，但對(duì)乙型溶血性鏈球菌高度敏感，抑菌圈大于15 mm；不同植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌效果差異較大，其中肉桂醛、香芹酚和牛至油對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌極為敏感，效果依次為肉桂醛＞香芹酚＞牛至油；肉桂醛與牛至油復(fù)配有協(xié)同作用，且比例為2：1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌效果最好。

有機(jī)酸具有提高動(dòng)物飼料利用率、抑制病源菌增生、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等多種功能（周夢(mèng)佳等，2019）。有研究表明，甲酸和丙酸可以抑制沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，檸檬酸可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增殖（王冰，2016）。本試驗(yàn)選取6種有機(jī)酸進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，6種有機(jī)酸均可抑制金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌生長(zhǎng)，其中甲酸對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的抑菌效果最好。

大量研究表明，植物精油和有機(jī)酸共同使用具有很好的協(xié)同效果。張浩然等（2018）研究表明，有機(jī)酸中檸檬酸的抑菌，效果優(yōu)于山梨酸和苯甲酸，植物精油與檸檬酸以不同比例復(fù)合后均可明顯提高對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果；蘇皓瑀等（2021）研究表明，植物精油與辛酸等酸化劑一起使用對(duì)致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌梭菌的抑菌效果比單獨(dú)的植物精油更強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合精油肉桂醛和牛至油與甲酸復(fù)合具有協(xié)同作用，且復(fù)合精油與甲酸比例為1：1時(shí)效果最好。

4 結(jié)論

本研究表明，15種植物精油和6種有機(jī)酸對(duì)致病菌均有抑制作用，其中肉桂醛和甲酸對(duì)金黃葡萄球菌和溶血性鏈球菌的抑菌效果最好；肉桂醛與牛至油最佳組合為2：1；復(fù)合精油與甲酸復(fù)合提高了整體抑菌效果。