超高效液相色譜-串聯質譜法測定牧草中22種農藥殘留

謝 敏，張 靜，王夢芝，周瑤敏，張大文，費 丹，趙立軍*，徐 俊*

（1.江西省農業科學院農產品質量安全與標準研究所，江西省農產品質量安全重點實驗室，江西南昌 330200；2.四川省飼料工作總站，四川成都 610041；3.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

苜蓿因富含蛋白質和能量，素有“牧草之王”的美譽，是草食動物優質的飼草來源。在苜蓿種植過程中，病蟲害較多，如褐斑病、銹病、花葉病、霜霉病；蟲害多達10余種，包括蚜蟲、草地螟、薊馬等（周春雷，2008；魯鴻佩等，2008）。目前病蟲害防治仍以噴施高效氯氰菊酯、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪等農藥為主（劉霞等，2019）。苜蓿每年收割2～5茬，有些種植戶為預防病蟲害的發生，常常加大農藥劑量和噴施頻率，進而導致苜蓿中農藥殘留問題。與此同時，苜蓿等牧草通過根系吸收土壤中累積的農藥也會造成農藥殘留，通過飼喂進入動物體內，且因牛、羊等反芻動物牧草攝入量大，更易造成體內農藥的慢性蓄積，導致動物組織和奶產品中出現農藥殘留，其中一些是國家違禁藥物成分，會對人體健康造成危害。再加上我國每年進口苜蓿量很大，其質量安全在一定程度上影響我國畜產品的質量安全。

盡管目前國內外關于農藥殘留檢測的報道較多（Lee等，2020；Viera等，2017；王峰恩等，2017），但針對牧草中農藥殘留檢測的研究較少，已有報道要么數量較少（谷旭等，2021）要么種類單一（孫婷婷等，2021），難以滿足現有檢測需求。因此，進一步研究牧草中多種農藥殘留精準分析方法意義重大。當前，農藥殘留檢測主要有液相色譜-質譜法（Chen等，2019）和氣相色譜-質譜法（孫婷婷等，2021），而液相色譜-質譜法因其靈敏度高、選擇性強等特點，已成為農藥殘留檢測分析領域的主要方法。鑒于此，本研究以苜蓿為代表，通過乙腈提取，QuEchERS法凈化，C18色譜柱分離，多反應監測模式測定，建立了牧草中22種農藥殘留的分析方法，以期為牧草質量安全監管及其農藥殘留風險評估提供科學依據，同時也為牧草的進出口檢測提供了一種準確的定量分析方法。

1 試驗方法

1.1 儀器和試劑 超高效液相色譜-串聯質譜儀；N-EVAP112 氮吹儀；GL-88B型旋渦混合器。

甲胺磷、氧樂果、滅多威、噻蟲嗪、3-羥基克百威、多菌靈、樂果、啶蟲脒、磷銨、氯蟲苯、烯酰嗎啉、滅線磷、馬拉硫磷、三唑磷、氯唑磷、苯醚甲環唑、氟蟲腈砜、蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、甲拌磷、丙溴磷標準品；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、硫酸鎂（MgSO4）、石墨化炭黑（GCB），試劑和溶劑均為分析試劑級或高效液相色譜級。

1.2 標準溶液配制 準確稱取上述22種農藥標準品，用乙腈分別配置成1000.0 mg/L的單標儲備液，然后用乙腈分別稀釋成質量濃度為10.0 mg/L的單標中間液，再用乙腈稀釋制備成混合標準工作液，混合標準工作液中各農藥質量濃度為1.0 mg/L，-20℃下避光儲存備用。

1.3 UPLC-MS/MS條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm×1.8μm，美國 Agilent公司）；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；進樣量：10μL；柱溫：35℃；梯度洗脫程序為：0～4 min，B由2%線性變至80%；4～6 min，B由80%線性變至98%；6～8 min，B保持98%；8～9 min，B返回初始2%。

1.3.2 質譜條件 電離模式：電噴霧電離正負離子模式（ESI+和ESI-）；檢測方式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：3000 V；離子源溫度：150℃；干燥氣溫度：150℃；干燥氣流量：15 L/min；霧化氣壓力：30 psi；鞘氣溫度：300℃；鞘氣流量：12 L/min；噴嘴電壓：500 V（ESI+）和1000 V（ESI-）。各農藥其他質譜參數見表 1。

表1 22種農藥質譜參數

1.4 樣品制備 樣品切成1 cm長，冷凍干燥研磨成粉，干燥器封存。

1.5 樣品前處理 準確稱取1.00 g苜蓿樣品于50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液浸泡10 min，渦旋1 min。再加入20 mL乙腈，渦旋 1 min，超 聲 15 min，4000 r/min 離 心 5 min，取5 mL上清液轉移至盛有300 mg無水MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和 5 mg GCB 吸附劑的15 mL離心管中，渦旋 1 min，4000 r/min 下離心5 min。取1 mL上清液，加入1 mL純水，渦旋混勻，過0.22μm水相微孔濾膜，待檢。

2 結果與討論

2.1 前處理方法優化

2.1.1 提取劑選擇 苜蓿干燥后含水量較低，提取前加水可加大樣品分散度，增加比表面積，提升溶劑與樣品接觸面積，提取效果更佳（Lehotay等，2010）。且使用飽和氯化鈉更有利于水與提取劑分層。因此，本方法選擇在加提取溶劑前先加入飽和氯化鈉溶液浸泡。

由圖1可知，乙腈和1%乙酸乙腈效果最好，22種農藥回收率均在65%～120%之間，其他2種提取溶劑效果不佳。考慮到含1%乙酸乙腈溶液會導致部分堿性農藥分解，于是選擇乙腈作為最終提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取回收率

2.1.2 凈化方法優化 參考農藥殘留檢測常用的 QuEChERS方法（Chen等，2019）、Florisil PR（王帥等，2021）和活性炭固相萃取柱（趙阿璇等，2021）等對苜蓿樣品進行凈化，結果如圖2。

由圖2可知，QuEChERS的綜合回收率和提取效果較好，除3-羥基克百威、多菌靈、樂果、啶蟲脒、磷銨的回收率超過120%，其他17種農藥回收率范圍均在80%～120%之間。

圖2 不同凈化方法回收率

2.2 基質效應、線性范圍、檢出限和定量限 采用純溶劑和苜蓿基質分別配制標準曲線，以二者斜率計算基質效應（ME），發現22種農藥均存在基質效應，除樂果基質增強效應外（402%），其余均存在基質抑制效應（-10%～-71%）。因此，試驗采用空白樣品溶液配制的系列混合標準溶液制作工作曲線降低了基質干擾。

采用空白基質加標配制質量溶度為0.5、1、2、5、10、20μg/L 的系列標準溶液，以濃度 - 峰面積繪制標準曲線，22種農藥線性良好，R2均大于0.994。將標準溶液稀釋至信噪比（S/N）為3和10的溶度分別定為化合物的檢出限和定量限，結果如表2，22種農藥的LODs為0.01～0.2μg/kg，LOQs為0.02～0.5μg/kg，符合多種農藥殘留分析要求。

2.3 回收率和精密度 采用空白樣品中添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，每個濃度設6個平行，計算回收率和相對標準偏差（RSD），其結果如表2。方法回收率為73.7%～107.1%，RSD為0.7%～9.8%，滿足農藥的殘留檢測要求。谷旭等（2021）采用QuEChERS前處理結合液相色譜-串聯質譜技術檢測了苜蓿中樂果和甲基異柳磷等15種農藥殘留，回收率為76.7%～118.5%，相對標準偏差0.9%～19.3%。張立田等（2019）采用液相色譜串聯質譜法測定青貯玉米中滅多威和3-羥基克百威等8種氨基甲酯類農藥殘留，回收率為70.83%～86.67%，相對標準偏差0%～8.15%。本研究結果與前人的研究結果相吻合，但本文檢測的農藥種類更多、靈敏度和精密度更高，是牧草農藥殘留檢測方法的補充，在滿足牧草樣品檢測要求的基礎上具有更廣泛的應用價值。

表2 基質效應，檢出限和定量限及不同添加濃度的回收率和精密度（n=6）

3 結論

采用UPLC-MS/MS方法建立了同時檢測牧草樣品中22種農藥殘留的檢測方法。該方法前處理簡單，檢測限和定量限更低，測定結果準確，能滿足牧草樣品中農藥殘留分析要求。