羊毛中驅蚊酯長效驅避劑檢測方法建立及其緩釋性能研究

趙 聰，岳治光，寧曉冬，黃斌斌，陳 倩，張素梅，菅復春，張龍現，王榮軍，寧長申*

（1.河南農業大學 動物醫學院，河南 鄭州 450002；2.河南安進生物技術股份有限公司，河南 鄭州 450011；3.河南應用技術職業學院，河南 鄭州 450042）

目前，生產中主要采用殺滅性的藥物來應對蜱害，手段主要包括環境噴灑殺蟲劑、藥浴、口服或注射驅蟲藥等，這類方法雖可以有效殺滅硬蜱，但無法避免硬蜱對家畜的叮咬。而且殺滅性藥物的使用可能會帶來動物產品藥物殘留、環境污染以及硬蜱耐藥性等問題，不利于硬蜱防控工作的進行。而驅避劑則可以避免這類問題，其作用機制主要是通過發出氣味使硬蜱忌避、逃跑，進而達到防止硬蜱叮咬家畜的目的。驅蚊酯（IR3535）是一種廣譜、高效的昆蟲驅避劑［1-2］，噴灑在家畜體表可以有效減少放牧時來自硬蜱的侵害，但驅蚊酯噴灑在家畜體表后的有效成分往往流失較快，達不到持久的驅避效果［2-7］，因此，如何增強驅避劑的緩釋效果，延緩有效成分的釋放是驅避劑研制的重點［8］。

由于牛羊等放牧家畜體表覆有被毛，對其噴灑驅避劑后，驅避成分多附著于毛發上，因此，可以將家畜的毛發作為驅避劑緩釋性能研究的載體，使用驅蚊酯處理羊毛，并在不同時間點測定羊毛中的驅蚊酯含量，進一步研究驅蚊酯制劑的緩釋性能。考慮到采用噴灑的方式可能會造成驅避劑在毛發上分布不均勻，干擾動物毛發中驅蚊酯的定量分析，為此，本研究通過浸泡的方式處理羊毛樣品，取出干燥后于不同時間點測定其中驅蚊酯含量，并建立了一種羊毛中驅蚊酯含量的檢測方法，進而研究了不同配方驅蚊酯驅避劑的緩釋性能，以期篩選出一種驅蚊酯長效驅避劑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 JEA302電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；KQ-100B超聲波清洗機（上海合金超聲設備有限公司）；GC-2011氣相色譜儀（上海宜逸醇科學儀器有限公司）；AuW120D分析天平（日本SHIMADZU儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 驅蚊酯原料（98%）購自廣州花之王化工有限公司；驅蚊酯標準品（97.7%）購自世紀奧科生物技術有限公司；鄰苯二甲酸二甲酯（99.7%）購自美國CATO RESERCH CHEMICALS INC；95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乳化劑0P-10均為分析純。

1.1.3 供試藥物 由4種緩釋物質（聚乙二醇- 400、聚乙烯吡咯烷酮、α-吡咯烷酮、丙三醇）按不同比例配制而成的A、B、C、D 4種1%驅蚊酯長效驅避劑；1%驅蚊酯水溶液。以上供試藥物由河南農業大學寄生蟲學實驗室與河南安進生物技術股份有限公司聯合研制。

1.1.4 供試羊毛 采自陜西省麟游縣某波爾山羊種羊場的成年波爾山羊。沿山羊脊背部用剪刀剪取長度大于5 cm的羊毛約30 g，裝入自封袋中，置冰盒中帶回實驗室，4 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊毛預處理 將羊毛分別放入去離子水、95%乙醇中，超聲清洗2次，每次10 min，以洗去羊毛表面的水溶性、脂溶性雜物；將羊毛在室內靜置晾干，然后剪成長度為3 cm的小段，分成15份，每份精確稱取0.1 g，分別放在10 cm×10 cm稱量紙上，折疊包封后用訂書釘固定四角，用6號針頭在包封袋上按3×3共打9個孔，室溫保存備用。

1.2.2 氣相色譜條件及參數 氣相色譜法色譜柱為SE-54毛細管柱；進樣口溫度230 ℃；檢測器溫度250 ℃；柱室溫度230 ℃；流量2.4 mL/min；分流比50∶1；載氣流量300 mL/min；氫氣流量20 mL/min；載氣為氮氣；進樣量2 μL［9］。

1.2.3 試驗條件的優化篩選 影響驅蚊酯測定時峰面積的主要因素包括：羊毛浸泡的配方濃度、羊毛質量、萃取溫度、萃取時間、萃取液體積、浸泡時間6個因素，除去羊毛浸泡的驅避劑濃度（1%）及羊毛質量（0.1 g）為固定值外，對其他4個影響因素設計了4個單因素試驗來確定最佳試驗條件，每個單因素試驗處理組設置3個重復（萃取溫度、萃取時間、萃取液體積、浸泡時間的初始值分別為35℃、10 min、10 mL、10 min）。

1.2.3.1 萃取溫度對驅蚊酯峰面積影響的測定 將預處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復，在濃度為1%驅蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干羊毛后放入裝有10 mL無水乙醇的試管內浸泡10 min，然后分別于20、25、30、35、40 ℃的條件下密封萃取15 min，吸取萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.2 萃取時間對驅蚊酯峰面積影響的測定 將預處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復，在濃度為1%的驅蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干后放入裝有10 mL無水乙醇的試管內浸泡10 min，然后在35 ℃密封條件下分別萃取5、10、15、20、25 min，吸取萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.3 萃取液體積對驅蚊酯峰面積影響的測定將預處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復，在濃度為1%的驅蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干后分別放入裝有3、5、7、10、13 mL無水乙醇的試管中浸泡10 min，然后在35 ℃的密封條件下萃取20 min，獲得萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.4 羊毛在萃取液中浸泡時間對驅蚊酯峰面積影響的測定 將預處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復，在濃度為1%的驅蚊酯配方溶液中分別浸泡后取出，晾干后放入裝有3 mL無水乙醇的試管中分別浸泡5、10、15、20、25 min，然后在35 ℃的條件下密封萃取20 min，獲得萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.4 羊毛中驅蚊酯含量的測定

1.2.4.1 標準曲線的繪制 稱取驅蚊酯標準品75 mg于50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制備成1.5 mg/mL的對照品儲備液；另稱取鄰苯二甲酸二甲酯（內標物）50 mg，置于50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制得1 mg/mL的內標溶液，在4 ℃冰箱保存。用移液槍分別移取對照品儲備液20、60、100、300、800 μL于1 mL容量瓶中，分別加入鄰苯二甲酸二甲酯內標溶液0.1 mL，用丙酮定容到1 mL，配制成驅蚊酯質量濃度分別為30、90、150、450、1200 μg/mL的系列對照品溶液，進樣測定，以對照品和內標物的峰面積比（A/Ai）為縱坐標，以質量濃度比（C/Ci）為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.4.2 萃取液中驅蚊酯含量的測定 不同配方浸泡過的羊毛經優化篩選出的試驗條件處理，吸取萃取液0.9 mL于1 mL的容量瓶中，并加入內標溶液0.1 mL，得到的加標萃取液進樣測定，并計算羊毛上附著的驅蚊酯含量，計算公式為：

1.2.4.3 回收率和精密度的測定 在50 mL容量瓶中分別加入驅蚊酯標準品125、250 mg，配制成質量濃度分別為2.5、5.0 mg/mL的驅蚊酯標準溶液。用分析天平稱取2份0.1 g的羊毛，用移液槍在對應羊毛上分別緩慢滴加5、10 mg/mL的驅蚊酯標準溶液100 μL，后轉入安瓿瓶中，經優化篩選出的試驗條件處理后，使用氣相色譜儀進樣，測取實際驅蚊酯含量，與添加量進行比值，測得500和1000 μg 2個添加水平的回收率。一天內試驗重復3次，計算日內精密度；一周內試驗重復3次，測得日間精密度。

1.2.5 驅避劑緩釋性能測定及其釋放曲線繪制每個處理組取24份經過預處理的羊毛，分成8組（于8個時間點測定），每組3個重復，放入相應驅避劑配方的樣品和無緩釋成分的對照組（驅蚊酯水溶液）中充分浸泡后取出，將紙袋打開，使羊毛暴露于空氣中，在留樣室放置（室溫23 ℃±2 ℃、相對濕度40%±5%）。晾干后，取第一組羊毛在優化篩選的方法下測定的驅蚊酯含量為初始含量；之后分別在1、2、3、5、8、12、18 d后取相應天數的羊毛，測定其驅蚊酯含量，并結合初始含量換算得到對應時間點的驅蚊酯相對釋放率，繪制不同配方的驅蚊酯相對釋放曲線。使用SPSS軟件的Kruskal-Wallis H檢驗對不同配方驅蚊酯驅避劑在同一時間點的載藥量進行差異性分析，并使用Origin 2018軟件對所得到的不同配方驅蚊酯釋放曲線進行方程擬合，進而評價A、B、C、D 4種驅蚊酯制劑的緩釋性能。其中：

2 結果與分析

2.1 試驗方法的優化篩選

2.1.1 萃取溫度對驅蚊酯峰面積的影響 如圖1所示，在其他條件不變的情況下，萃取溫度在20~35 ℃區間內，驅蚊酯的峰面積隨著萃取溫度的升高而變大，且相互間存在顯著差異（P＜0.05），當溫度為40 ℃時，峰面積與35 ℃時差異不顯著。

圖1 萃取溫度對驅蚊酯峰面積的影響

2.1.2 萃取時間對驅蚊酯峰面積的影響 如圖2所示，萃取時間在5～20 min內，驅蚊酯的峰面積隨著萃取時間的增加而變大，峰面積由（598.3±11.0）mAU增加到（2538.9±59.6）mAU，差異顯著（P＜0.05）；在25 min時，驅蚊酯的峰面積較20 min時變化較小，沒有顯著差異。

圖2 萃取時間對驅蚊酯峰面積的影響

2.1.3 萃取液體積對驅蚊酯峰面積的影響 如圖3所示，隨著萃取液用量的減少，驅蚊酯檢測的峰面積變大，不同體積萃取液之間的驅蚊酯峰面積差異顯著（P＜0.05），當萃取液用量為3 mL時，峰面積最大，為（3134.7±65.3）mAU。

圖3 萃取液體積對驅蚊酯峰面積的影響

2.1.4 羊毛浸泡時間對驅蚊酯峰面積的影響 如圖4所示，在5~15 min內，隨著羊毛在萃取液中浸泡時間的延長，驅蚊酯的檢測峰面積也逐漸變大；浸泡時間在15 min時，對應的峰面積為（4325.7±14.6）mAU；浸泡時間在20、25 min時，驅蚊酯峰面積差異不顯著。

圖4 羊毛在萃取液中浸泡時間對驅蚊酯峰面積的影響

結合以上結果，供試羊毛在3 mL無水乙醇中浸泡15 min后，并在35 ℃條件下萃取20 min可以獲取驅蚊酯的最大檢測峰面積。

2.2 羊毛驅蚊酯沾染含量的測定

2.2.1 驅蚊酯的標準曲線 由所測數據可知，驅蚊酯在30~1200 μg/mL時，呈良好的線性關系。以對照品和內標物的峰面積比（A/Ai）為縱坐標，以質量濃度比C/Ci為橫坐標繪制標準曲線。如圖5所示，驅蚊酯標準曲線的回歸方程為y=0.5195x-0.1351，R2= 0.9996，結果符合要求。

圖5 驅蚊酯的標準曲線

2.2.2 回收率和精密度的測定 如表1所示，2個驅蚊酯添加水平的回收率在80%~96%之間，日內精密度和日間精密度在2.0%~3.5%之間。

表1 羊毛不同驅蚊酯滴加水平經萃取后的精密度和回收率結果

2.2.3 不同配方緩釋性能的測定 羊毛上驅蚊酯載藥量（表2）和釋放率（表3）隨時間的變化情況以及釋放曲線（圖6）表明，各處理組羊毛中在5 d內的驅蚊酯釋放量最大，相對釋放率均在70%以上。對不同處理組進行比較，0 d時各處理組間初始羊毛驅蚊酯載藥量在9137.2~9488.8 μg之間，相互之間沒有顯著差異。1~8 d內，A、C、D組在羊毛中驅蚊酯載藥量均大于同時期的對照組，且差異顯著（P＜0.05）。D組在1~8 d內，每克羊毛驅蚊酯載藥量分別為（5892.6±178.7）、（4383.0±159.5）、3235.8、2436.6、（1729.8±53.8）μg，顯著大于其他處理組（P＜0.05），其相對釋放率分別為35.5%、52.0%、64.3%、73.3%、81.1%；A、C組8 d內每克羊毛驅蚊酯載藥量均顯著大于對照組，其中A組僅在1 d時其驅蚊酯載藥量顯著高于C組，在其他檢測時間點與C組均無顯著差異；而B組則在整個試驗過程中每克羊毛中驅蚊酯載藥量與對照組均沒有顯著差異，各時間點的相對釋放率也較為接近；12~18 d時，A、B、C組及對照組的曲線趨于平緩，變化幅度小，A、B、C 3個處理組每克羊毛中驅蚊酯載藥量相互之間沒有顯著差異，18 d時各處理組間驅蚊酯載藥量差異均不顯著，相對釋放率在88.4%~90.9%之間。

圖6 不同處理組驅蚊酯的相對釋放曲線

表3 不同天數下每克羊毛驅蚊酯相對釋放率 %

驅蚊酯相對釋放曲線的方程擬合如表4所示，在5個處理組所得到的擬合方程中，以一級方程的擬合度最好，R2均在0.95以上。在一級方程的基礎上將各處理組的驅蚊酯釋放曲線在0~18 d內進行積分，結果顯示D組驅蚊酯長效驅避劑的積分面積最小，為1349.35 mAU，小于A、B、C組及對照組的1429.69、1502.42、1431.55、1523.46 mAU。

表4 不同處理組驅蚊酯相對釋放曲線的擬合方程

3 討論

要對羊毛中驅蚊酯的含量進行檢測，首先需要建立羊毛中驅蚊酯含量的檢測方法。在對羊毛中驅蚊酯萃取溫度的篩選中，適當地提高萃取溫度，可以使分子間的運動速度加快，提高驅蚊酯在萃取液中的溶解度，進而提升萃取效率［10］。理論上萃取時間太短會導致溶劑和溶質達不到良好的接觸，造成萃取效率較低；相應地增加萃取時間，可以使萃取更加充分；但當萃取時間增加到一定程度時，傳質動力的降低使萃取效率達到一定水平后不再增加［11］。萃取液的用量對檢測時的峰面積影響較大，適當減少萃取液的用量可以增加萃取液中驅蚊酯的濃度，進而有效擴大其峰面積；但用量也不能過少，要保證羊毛可以完全浸沒在萃取液中，使羊毛與萃取液的接觸面積達到最大，進而增加驅蚊酯的峰面積。

在驅避劑的研制中，除了發掘更有效、安全的驅避劑成分之外，另一個研究方向就是采用一些技術手段延緩驅避物質在使用時的揮發以及透皮吸收現象，使有效成分長時間附著在保護對象上，從而達到人畜免受吸血寄生蟲侵擾的目的。目前，驅避劑的主要緩釋手段包括高分子聚合物、微膠囊、包結化合物、脂質體、水凝膠，并可以將其加工成油膏、乳劑、霜膏、噴霧劑、酊劑、氣霧劑、摩絲、粉劑等劑型［12-14］。Chung等［15］采用微膠囊方法，以三聚氰胺-甲醛預聚物為壁材，以香茅油為芯材，采用原位聚合法制備了含有香茅油的微囊，結果顯示，該香茅油微囊在常溫下放置8周后，其微囊內的香茅油含量依然在80%以上。董桂蕃等［16］開發了一種以水溶性高分子化合物為載體材料的透明狀水凝膠劑型，與普通酊劑和霜劑比較，明顯延長了驅避時間，室內試驗和現場驅蚊效果試驗對埃及伊蚊和白紋伊蚊均表現出良好的驅避效果。Yim等［17］研究了茶樹油（TTO）乳劑和2種環糊精包結復合物的緩釋型（SR）和改性緩釋型（FR）對硬蜱的驅避效果，結果顯示，FR在3 d內幾乎具有完全驅避效果（99.5%），到第15天依然可以驅避49%硬蜱。另外，驅避劑的使用效果除了受緩釋技術的影響之外，亦受較多其他因素的影響，如吸血昆蟲的種類、密度、宿主的生理狀態、個體差異以及使用時的環境情況等［18-20］。

4 結論

本研究建立了羊毛中驅蚊酯氣象色譜法檢測方法，試驗羊毛于3 mL無水乙醇中浸泡15 min后，在35 ℃條件下萃取20 min后羊毛萃取液中可以獲得驅蚊酯的最大峰面積。在對A、B、C、D 4組不同配方的驅蚊酯長效驅避劑緩釋性能測定中，與驅蚊酯水溶液組相比，A、C、D組制劑均有不錯的緩釋效果，其中D組制劑的緩釋效果最好，可在12 d內有效延緩驅蚊酯的釋放；而B組制劑的緩釋效果不明顯。