鉀鎂肥優化施用對烤煙后期光合熒光特性和碳氮代謝酶活性的影響

謝榕榕，柯玉琴，李文卿，李春英，鄭朝元，吳良泉

（1.福建農林大學 資源與環境學院/國際鎂營養研究所，福建 福州 350002；2.福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；3.福建省煙草專賣局 煙草科學研究所，福建 福州 350013）

0 引言

鎂營養在植物生長過程中起著重要作用，葉片中的鎂參與蛋白合成，35%的鎂存在于葉綠體中［1］；Mg催化谷胱甘肽合酶、磷酸激酶、RNA聚合酶等300多種酶反應［2］，因此，植物體中鎂營養狀況直接或間接影響光合作用、碳水化合物分配、硝酸還原等過程［3］。與此同時，鉀和鎂對光合作用過程和光同化物的運輸起著至關重要的作用，介導蔗糖運輸和光同化物的分布［4］。鎂在土壤中的有效性低，這主要是鎂離子具有較大的水合半徑，與土壤膠體吸附性差，易被淋洗而損失，導致雨量充沛的南方煙區土壤鎂的有效性低，含量也低［5-6］。另外，離子間的拮抗作用，鉀鎂之間的拮抗互作被認為是缺鎂的主要原因［7］；鉀鎂比例增大會導致土壤缺鎂［8］。因此，在福建煙區提高鎂營養的有效性十分迫切。

福建煙區烤煙生長后期常遇高溫強光氣候，熱脅迫對烤煙品質有負影響。有研究表明，充足鎂供應能夠減輕玉米和小麥的熱脅迫［9］，在較低光強下生長的葉片有高達57%的鎂與葉綠素結合，而在高光下生長的葉片中結合比例僅為37%，鎂缺乏的反應是葉綠素濃度的降低［9］，但在烤煙上關于調整鉀鎂比例對光合作用以及碳氮代謝的影響研究還較少。

烤煙生產中常施用較多的鉀肥，以提高煙葉鉀含量，提高煙葉產量和品質。若烤煙種植上忽視鎂肥的補充，則會影響煙株生長和品質形成，且較高的施鉀量會進一步抑制煙株吸收鎂。本研究通過優化鉀鎂施肥處理，減少鉀肥施用，增加鎂肥施用，以期達到平衡煙株營養的效果，為優化烤煙田間養分管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和品種

試驗在福建省煙科所宦溪科研基地進行。品種為當地主栽品種翠碧一號（Nicotiana tabacum L. cv CB-1）。土壤pH值4.96。試驗區基礎肥力情況見表1。

表1 試驗區基礎肥力情況 mg/kg

1.2 試驗設計

根據氮磷鉀的配比，共設4個處理： T1為對照，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶3，施鉀量（K2O）為315 kg/hm2，不施鎂肥；T2為鉀肥優化處理，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施鉀（K2O）量為210 kg/hm2，不施鎂肥；T3為鉀鎂肥配施1，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施鉀量（K2O）為210 kg/hm2，施鎂量（MgO）為19.5 kg/hm2；T4為鉀鎂肥配施2，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施鉀量（K2O）為210 kg/hm2，施鎂量（MgO）為39.0 kg/hm2。

各處理施氮量為105 kg/hm2，施磷量（P2O5）為71.4 kg/hm2，肥料種類分別為專用肥（N∶P2O5∶K2O=12∶8∶22）855 kg/hm2，復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）15 kg/hm2，基肥、追肥比例為66∶34。T1處理施用硫酸鉀240 kg/hm2，T2、T3和T4處理施用硫酸鉀45 kg/hm2，均在煙株大開盤時雙側條施；鎂肥為化學純氧化鎂，全部在移栽前1周條施。每處理種植98株，行株距為1.2 m×0.5 m，隨機區組排列，重復3次。2019年1月25日移栽。除試驗處理不同外，其余栽培措施均參照當年優質煙生產技術方案。

1.3 測定項目

移栽前取土樣，測定土壤中有機質、水解氮、有效磷、速效鉀、交換性鎂、微量元素的含量以及pH值。在烤煙成熟采收期（5月29日）每個處理測定上部倒2葉位的光合、熒光參數，同時取各處理上部倒2～3葉位葉片，帶回實驗室，剔除主脈后測定各生理指標。

葉綠素含量的測定：用80%丙酮浸提24 h，利用可見分光光度計分別在470、646和663 nm 3個波長處進行吸光度測定。

光合參數采用英國PP-system公司生產的CIRAS-II型便攜式光合儀測定，測定光強為1000 μmol/（m2·s），CO2濃度為380 μL/L；熒光參數采用Hansatech公司生產的Pocket PEA便攜式葉綠素熒光計測定，每個處理重復測定5片葉，同時計算熒光動力學JIP-test參數，涉及的JIP-test參數如表2所示［10］。

表2 JIP-test快速葉綠素熒光誘導動力學曲線 （OJIP） 參數

RuBPCase的活性采用酶聯生物的試劑盒，用酶聯免疫分析（ELISA）方法測定。硝酸還原酶（NR）的活性采用活體法測定。谷氨酰胺合成酶（GS）的活性參照鄒琦等［11］的方法測定。蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）的活性參照劉以前等［12］的方法測定。

1.4 數據統計分析

數據的初步統計作圖等由Excel 2010軟件完成，方差分析和多重比較由DPS 7.05軟件完成。

2 結果與分析

2.1 不同處理對采收期烤煙光合特性的影響

2.1.1 不同處理對采收期烤煙葉綠體色素含量的影響 如表3所示，與常規施肥（T1）相比，減少鉀肥施用 （T2）有增加葉綠體色素含量的趨勢，但增幅不顯著。在降低鉀肥的基礎上增加鎂肥施用（T3）能有效增加葉綠體色素的含量，其中總葉綠素 （Chl）、葉綠素a（Chla）含量較T2極顯著增加（P＜0.01）。隨著鎂肥施用量進一步增加（T4），Chl、Chla、Chlb和Car含量均顯著增加。降低鉀鎂比例，烤煙各處理葉綠素中Chl含量的增幅分別為2.2%、11.8%、18.3%，Car含量的增幅分別為3.5%、17.5%、19.7%，說明在常規施肥的基礎上降低鉀肥的施用量能在一定程度上提高色素含量，通過減鉀增鎂降低鉀鎂養分比例可以顯著提高煙葉色素含量，色素含量均在T4處理鉀鎂比最低時達到最大值。

表3 不同處理對采收期烤煙葉綠體色素含量的影響 mg/g

2.1.2 不同處理對采收期烤煙光合參數的影響 凈光合速率（Pn）、細胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）等光合參數是表征光合作用強弱的指標。由表3可知，與常規施肥（T1）相比，減少鉀肥施用量 （T2）極顯著 （P＜0.01）提高了葉片的Pn和Gs；Tr也有增加趨勢，但增加不顯著；Ci則表現為顯著下降。

在優化施肥加鎂的2個處理中，施鎂量為19.5 kg/hm2時，Tr、Pn、Gs和Ci均表現為增加的趨勢，但僅Tr達到顯著水平；在優化施肥加鎂19.5 kg/hm2時，Tr、Pn、Gs的值最高，此時光合作用最強；隨著鉀鎂比值繼續降低，當鎂肥施用量達到39.0 kg/hm2時，Tr、Pn、Gs開始表現出下降趨勢，光合作用開始減弱。

優化施肥中，Pn、Tr、Gs、Ci值隨著鎂肥施用量的增加而呈現倒V型變化。各處理Pn值：T3＞T2＞T4＞T1，說明優化施肥+19.5 kg/hm2鎂肥能有效促進光合作用進行。

表4 不同處理對采收期烤煙光合參數的影響

2.1.3 不同處理對采收期烤煙葉綠素熒光參數與JIP-test參數的影響 由表5可知，優化施肥與加鎂處理采收期烤煙葉綠素Fo無顯著差異，說明優化施肥通過調整鉀鎂比例對光系統Ⅱ沒有顯著影響。相較于常規處理，減少鉀施用量的各處理煙葉的Fm、Fv、Fv/Fm值極顯著地增加，Fv/Fo也有增加的趨勢，進一步說明了降低鉀鎂比值能有效提高采收期烤煙的光合作用，促進采收期碳代謝。降低鉀鎂比例，烤煙各處理最大熒光（Fm）的增幅分別為13.3%、18.0%、24.1%；可變熒光（Fv）的增幅分別為 17.3%、23.6%、30.9%；Fv/Fo的增幅分別為11.0%、17.2%、23.1%；Fv/Fm的增幅分別為3.7%、4.7%、5.5%。各處理中以鉀鎂比最低的T4處理的Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值最高，說明增加鎂肥施用能維護光系統光化學反應功能，T4處理下采收期烤煙葉光系統光化學反應功能最佳。

表5 不同處理對采收期烤煙葉綠素熒光參數的影響

從圖1可見，優化施肥處理后JIP-test參數Sm、N、ETo/RC、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、PIABS、PItotal、RC/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo、TRo/ABS、ETo/ABS、ETo/TRo值均大于常規施肥處理。各處理的Sm變幅趨勢為T3＞T4＞T2＞T1；N的變幅趨勢為T4＞T2＞T3＞T1；ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、PIABS、PItotal、RC/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo、TRo/ABS、ETo/ABS、ETo/TRo的變化趨勢為T4＞T3＞T2＞T1。優化加鎂的T3、T4處理的ETo/CSm、PIABS、PItotal、ETo/ABS、ETo/TRo值增大明顯，與農戶對照相比，T3處理的分別增長了32.23%、68.26%、56.28%、22.34%、19.36%，T4處理的分別增長了45.87%、86.89%、39.00%、31.19%、26.53%。隨著鉀鎂比例下降，TRo/RC、ABS/RC值有下降趨勢，表明優化施肥后，天線色素中有更多的激發態葉綠素a將能量 （光子）傳遞到反應中心，減少無效的熒光產生。

圖1 不同處理對采收期烤煙熒光JIP-text參數的影響

2.2 不同處理對采收期烤煙碳氮代謝的影響

2.2.1 不同處理對采收期烤煙RuBPCase活性的影響 如圖2所示，與常規施肥相比，優化施肥、減少鉀肥施用顯著提高了采收期烤煙RuBPCase活性。與對照相比，優化加鎂處理通過降低土壤鉀鎂比例能在一定程度上提高煙株葉片RuBPCase活性，但T3處理與對照差異不顯著，T4處理顯著高于T1處理；T2、T3和T4處理間RuBPCase活性差異不顯著。說明鉀肥施用量偏高可能降低烤煙RuBPCase活性，進而影響采收期烤煙光合作用中碳同化過程。

圖2 不同處理對采收期烤煙RuBPCase活性的影響

2.2.2 不同處理對采收期烤煙NR活性的影響 硝酸還原酶（NR）是NO3-同化中第1個關鍵酶，生長后期較高的NR活性會阻礙碳氮代謝的轉換和適時落黃［2-3］。由圖3可知，與常規施肥（T1）處理相比，減少鉀肥的施用促進了葉片NR活性上升，其中T3處理達到顯著水平，但降鉀的3個處理間差異不顯著。降鉀優化處理可提高NR活性，促進NO3-轉化NO2-，有利于烤煙葉片維持一定的氮代謝。

圖3 不同處理對采收期烤煙NR活性的影響

2.2.3 不同處理對采收期烤煙GS活性的影響 谷氨酰胺合成酶（GS）是氮代謝中心的調節酶，參與催化無機氮合成谷氨酰胺［4］。如圖4所示，與常規施肥相比，降低鉀肥施用（T2）顯著提高了采收期烤煙GS活性，但降鉀的3個處理間差異不顯著。各處理以T4處理時GS活性最高，氮代謝中谷氨酰胺合成能力最強。說明降低鉀鎂比例能促進氮代謝中谷氨酰胺的合成過程。

圖4 不同處理對采收期烤煙GS活性的影響

2.2.4 不同處理對采收期烤煙SS活性的影響 蔗糖合成酶（SS）是一種可逆酶，既可以促進蔗糖分解生成腺苷二磷酸葡萄糖和果糖，也可以促進蔗糖的合成，具有協調植物蔗糖和淀粉含量的功能［7-8］。圖5為不同處理對采收期烤煙SS活性的影響，優化施肥處理的SS活性顯著高于常規施鉀處理，其SS活性是常規施鉀肥（T1）處理的1.5倍，說明減少鉀肥施用量可以顯著提高SS活性；在優化加鎂肥施用處理中降低鉀鎂比例會降低SS活性，但其SS活性仍顯著高于常規施鉀肥處理。

圖5 不同處理對采收期烤煙SS活性的影響

3 討論

3.1 鉀鎂優化對烤煙光合特性與光合熒光特性的影響

已有研究表明，缺鎂植株的葉綠素含量下降［13］；當土壤有效鎂含量低時，隨著鎂肥施用量增加，采收期烤煙的光合作用有增強的趨勢［14-15］，這與本研究結果一致。在烤煙生產上，不施鎂肥的土壤，若施鉀量較高，導致鉀對鎂的拮抗作用，則鎂的有效性低，鎂作為葉綠素中心原子缺乏，不能及時合成葉綠素進行光合作用。本研究結果表明，優化加鎂能顯著提高煙葉葉綠素含量，降低鉀鎂比例能夠促進采收期煙葉葉綠體色素積累，其主要是通過增加Chla的含量來影響Chl含量。光系統Ⅱ活性增強，能夠提高烤煙采收期的光合作用。

在葉綠素熒光參數中，Fv/Fm反映光系統Ⅱ在逆境下光系統受傷程度，優化施肥隨著鎂肥的外源施用以及施用量的增加，Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值呈增加趨勢，說明優化施鉀肥并補施鎂肥可以促進烤煙煙葉光系統Ⅱ光化學反應進行，進而促進光合作用。這可能是因為鉀鎂比例降低，鎂有效性提高，光合組織中有充足的鎂，植物生理生化反應中復雜的相互作用會促進光合碳同化的進行［4］，導致優化加鎂處理Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值增大明顯。同時施用MgO 19.5 kg/hm2處 理 的 葉 綠 素 熒 光 JIP-test參 數ETo/CSm、PIABS、PItotal、ETo/ABS、ETo/TRo分別有不同程度上調，表明單位膜面積活性中心進入電子傳遞中的電子傳遞到有效電子受體（QA至QB，PQ，PC）的量子效率（ETo/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo）提高，PSⅡ、PSⅠ與電子傳遞之間整體活性（PIABS，PItotal）增加。已有類似研究結果表明，REo/ABS和PIABS，PItotal在缺鎂葉片和功能葉中降低，導致PSI末端電子受體減少，使這些葉片受到損害［16］；在缺鎂葉片中，光合電子傳遞鏈過度減少，從而增強了高活性氧的產生，在強光下影響更為嚴重［17］。隨著鎂的補充和鉀鎂比例下降，TRo/RC、ABS/RC值下降，聚光色素能夠將更多的光子傳遞到反應中心參與電子傳遞，此時發射熒光減少，也減少了活性氧的產生，減輕烤煙后期葉片損傷，這對烤煙生長后期遇上高溫強光的東南煙區有極其重要的意義。通過葉綠素熒光瞬態值計算的JIP-test參數表明優化加鎂處理后光反應活性中心效率也有一定的提高，說明提高鎂肥施用量促進烤煙采收期光合作用主要是通過提高煙葉單位面積光反應活性中心效率、電子傳遞的有效性實現的。同時，鎂能夠影響光合系統的整體協調性，對光合系統活性指數分析可知，PSⅡ活性指數（PIABS）隨著鉀鎂比例的降低而逐漸增大，T4處理時增幅為86.89%；T3處理時光合系統總活性指數（PItotal）最佳，這可能是因為在低Mg2+濃度下，鎂對光合系統的影響首先是聚光復合蛋白（LHCIIs）的橫向微組織發生變化，隨后兩個光系統發生分離［18］，缺鎂導致捕光葉綠素a/b蛋白（LHCP）從PSⅡ中脫離，從而增加光子從LHCP直接轉移到PSI的可能性［19］。也有研究認為缺鎂下植株葉片葉綠素降解，釋放鎂養分，并通過觸發LHCIIs降解來保護細胞免受光損傷［4］。成熟期煙葉細胞結構較完整，有利于煙葉烘烤過程中物質正常轉化，促進烤后煙葉外觀均勻。

3.2 鉀鎂優化對烤煙碳氮代謝酶活性的影響

氮代謝的關鍵酶硝酸還原酶（NR）的作用依賴光合作用提供還原力，有效鎂含量增加有利于氮同化的進行［20］。雷佳等［21］的研究表明，在烤煙全生育期中，NR活性在團棵期達到最大值，此后隨著烤煙成熟而逐漸降低；成熟期烤煙碳的固定代謝和轉化代謝開始減弱。本研究結果表明，優化加鎂能夠促進成熟期烤煙氮代謝的進行，同時鎂可以明顯提高Rubisco的活性。也有研究表明低濃度的Mg2+加速了Rubisco活性的增強，高濃度的Mg2+則減緩了Rubisco活性的增強［22］。優化加鎂促進Rubisco活性增加存在最適臨界點，與前人的研究結果一致；本研究發現鎂可以明顯提高Rubisco的活性。蔗糖合成酶催化蔗糖轉化為相應的核苷酸活化的葡萄糖衍生物，鎂的含量影響了其催化效率［23］。同時Zhao等［24］的研究表明Mg的缺乏降低了NR的活性，減少了Chl的合成。Yin［13］在菠菜上研究發現缺鎂降低了菠菜氮代謝關鍵酶NR、GS的活性。施鎂能促進烤煙生長后期碳氮代謝過程，促進碳氮代謝平衡，提高烤煙后期干物質積累，有利于烤煙煙葉品質優化［25］。本研究取樣時間為5月29日，剛進行了下部葉采收，此時測定結果表明降低鉀鎂比例，提高土壤鎂有效性，可以提高烤煙成熟期上部葉片碳氮代謝關鍵酶NR、GS、SS活性，促進成熟期烤煙碳氮代謝平衡，促進烤煙內在物質趨于平衡，在下部葉進入成熟期后，上部葉仍保持較好的碳氮代謝平衡，可在一定程度上延長煙株生育期，避免煙株提前衰老。

通過分析優化施鎂處理烤煙的碳氮代謝酶活性，結果表明優化鉀肥加鎂能提高碳代謝中RuBPCase、SS活性，這可能與鎂介導了RuBPCase封閉的六聚體的形成有關［26］；充足的鎂離子與RuBPCase結合，有利于羧化作用［27］，從而光合作用與碳固定增強，促進碳循環代謝。同時優化鉀肥加鎂能提高氮代謝中NR、GS活性。GS是氮同化的關鍵酶之一，Mg與GS的調控有關，鎂是GS的組成部分，具有構成GS結構和催化作用［28］。NR的去磷酸化和14-3-3蛋白的解離增加了NR的活性，Mg通過增加14-3-3蛋白與NR的相互作用增加NR活性［29］。

3.3 鉀鎂優化對烤煙生產的影響

在植物細胞中，Mg2+對植物具有重要的生物學功能，是合成葉綠素的中心原子、具有穩定核糖體結構和酶的輔助因子等功能［30］。在植物-土壤系統中，鉀和鎂元素之間的互作，既表現出協同作用又表現有拮抗作用，有研究表明兩者之間的拮抗作用以鉀對鎂的單方拮抗為主［31］，在低鎂低鉀供應下，促進植物對鉀、鎂養分的吸收；在高鉀低鎂條件下，植株吸收鎂養分顯著降低，合理施鉀會增加植物對Mg2+的吸收；而當鉀肥施用量較大時，由于鉀-鎂之間的拮抗作用，缺鎂癥狀可能會加劇。

本研究表明，在農戶常規施肥基礎上減少鉀肥施用，補施鎂肥，降低鉀鎂比例，有利于采收期煙葉葉綠體色素積累，增強植物光合作用，提高碳固定，增強碳氮固定代謝酶、轉化代謝酶的活性，為烤煙生長干物質積累提供最佳酶活性機制，促進烤煙碳氮代謝平衡。與鉀有關的有機酸對煙葉的燃燒性作用明顯，增施鉀肥能提高鉀氯比，從而改善燃燒性［32］。在烤煙生產上，為提高煙葉的燃燒性，常常施用大量鉀肥以提高烤煙的鉀含量。從本研究看，太高的施鉀量容易導致成熟期煙株內在光合作用、熒光特性、碳氮代謝等平衡過早被打破，不利于葉片正常成熟，這可能是導致東南煙區烤煙生長后期高溫逼熟的原因之一。因此，進行優化施肥十分必要，適當降低鉀肥施用，優化鉀鎂比例對成熟期烤煙保持較好的碳氮代謝平衡和正常成熟落黃有利，特別在福建生態條件下，有利于減緩烤煙生長后期受高溫強光傷害影響，提高煙葉烘烤品質。但煙葉田間生長時間延長，可能導致內在物質積累更充分，葉片身份增厚，需要優化烘烤工藝提高烘烤質量；同時，要適量施用氮肥，保障烤煙成熟期能夠適時成熟落黃。另外，在生產上調整鉀肥施用量，進行優化施肥，輔以少量鎂肥施用，能有效節約烤煙生產成本。

4 結論

本研究結果表明，在目前生產施鉀的基礎上減少鉀肥施用，優化鉀鎂比例能夠促進采收期煙葉葉綠體色素積累，顯著地增加烤煙煙葉Fm、Fv、Fv/Fm值，提升烤煙采收期光合作用中光合色素捕獲光能的能力，提高單位面積光反應活性反應中心效率、電子傳遞的有效性，促進光能轉化成化學能，提升采收期烤煙光反應系統的功能協調性，提高光反應系統的整體活性，進而提高凈光合速率，并減緩葉片受高溫強光傷害。NR活性在優化處理+MgO 19.5 kg/hm2的處理下最大，優化施肥能增加GS活性，有效提高烤煙RuBPCase活性，提高SS活性，促進烤煙生長后期碳氮代謝平衡，保障葉片正常成熟。當優化鉀鎂比例為10.77∶1、施用MgO 19.5 kg/hm2時烤煙的生理代謝功能最佳。