中國美利奴羊OAR1脫毛癥的基因組選擇分析

常倩倩，楊燁彰，李 睿，鄭浪漫,崔子龍，米熱妮薩·圖爾蓀托合提，陳鴻杰，劉春潔*，劉書東*

（1.塔里木大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

綿羊是新石器時(shí)代人類馴化的最早家畜之一［1］。綿羊給人們的生活提供了大量的肉類、奶類、毛皮等產(chǎn)品。中國美利奴羊是我國第一個(gè)細(xì)毛羊品種，于1985年培育成功，它的父本是澳大利亞美利奴羊，母本是新疆細(xì)毛羊。該品種的適應(yīng)性強(qiáng)、體型長，胸部寬且深，后肢肌肉豐滿，尾部寬而平直，頭部羊毛從頂部覆蓋至兩眼連線處，前肢羊毛覆蓋至腕關(guān)節(jié)處，后肢則羊毛覆蓋則達(dá)到腓關(guān)節(jié)；羊毛叢密度大、結(jié)構(gòu)好，羊毛較長且有明顯的彎曲，毛色一般呈乳白色或者油白色，凈毛量較高，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古和東北地區(qū)等，所產(chǎn)羊毛長、產(chǎn)量高且質(zhì)量好，羊毛的產(chǎn)量決定了羊毛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，但羊的脫毛癥給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。

羊脫毛癥是指羊的被毛脫落、根部萎縮、被毛發(fā)育不良等癥狀的總稱，是由于某種特殊病因，如缺乏營養(yǎng)和代謝紊亂、細(xì)菌感染、寄生蟲侵害、中毒等引起的一種非傳染性疾病［2］。在綿羊和山羊的群體中，脫毛癥是綿羊養(yǎng)殖過程中一種常見疾病，多見于泌乳期和妊娠后期的母羊［3］。羊脫毛癥在發(fā)病時(shí)，羊軀干和頸部的被毛會成片地脫落，被毛粗糙灰暗、無光澤，并呈現(xiàn)出不同程度的貧血，喜食雜物如黏土、污糞等。吃下去的雜物在胃內(nèi)會形成毛球，繼而出現(xiàn)便秘、腹痛、消化不良等癥狀，嚴(yán)重者表現(xiàn)為消瘦貧血、腹瀉，個(gè)別羊出現(xiàn)視力模糊，甚至死亡。脫毛癥發(fā)病率可高達(dá)20%~35%，多為農(nóng)業(yè)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)，死亡率通常較低，但會導(dǎo)致農(nóng)牧民減產(chǎn)減收和經(jīng)濟(jì)收入偏低。

目前，脫毛癥與基因的相關(guān)性主要在人類中的研究比較多，人類的斑禿（AA）是一種非瘢痕性的脫發(fā)，國外有研究稱斑禿疑似為自身免疫性疾病，AA的產(chǎn)生可能與異質(zhì)表型相關(guān)［4］。患有AA的人一般會出現(xiàn)較嚴(yán)重的脫發(fā)，不同患者的脫發(fā)面積大小不盡相同。在脫發(fā)癥狀出現(xiàn)一段時(shí)間后，其病灶有的會出現(xiàn)不同程度的減小，甚至完全消退；有的則會逐漸擴(kuò)大，延伸到整個(gè)頭皮。據(jù)研究稱，有大約2%的人會在一生當(dāng)中的不同階段出現(xiàn)AA。AA很可能是由環(huán)境、免疫和遺傳因素共同引起的疾病，這一結(jié)論已經(jīng)在多對同卵雙胞胎中得到驗(yàn)證，并且獲得了多代AA成員家庭的認(rèn)同［5］。

韓國慶熙大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東方藥物與加工系的一個(gè)研究小組稱，人參皂苷F2能夠通過2種生物學(xué)途徑控制細(xì)胞凋亡來降低脫發(fā)的發(fā)病率［6］。人參皂苷F2比魚肝素抑制毛細(xì)胞凋亡的效果更加顯著。他們的研究結(jié)果表明，人參皂苷F2降低了TGF-β2和SCAP蛋白的表達(dá)，這可能與細(xì)胞凋亡和進(jìn)入卡他根有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)DHT（二氫睪酮）可以通過減少生長因子TGF-β2來抑制毛發(fā)的生長，還能影響Smad-2基因的表達(dá)，這些因素以直接調(diào)控的方式影響毛細(xì)胞的凋亡［7］。

德國研究者表明，PTCH2基因可能被排除為脫 毛X型 的 致 病 因 素［8］。Lothrop和Schmeitzel提出，人類的CAH表型與狗的脫毛X表型具有一定的相似性。有90%~95%的人類CAH病例是由編碼類固醇21羥化酶的CYP21A2基因發(fā)生突變而引起的。歐洲一些藥物研究人員發(fā)現(xiàn)藥物抑制DGAT1可誘導(dǎo)小鼠和狗的皮脂腺發(fā)生萎縮，但卻只有小鼠出現(xiàn)明顯的脫發(fā)［9］，該研究組的結(jié)果表明，二酰甘油O-酰基轉(zhuǎn)移酶1（DGAT1）在合成脂類中具有非常重要的作用，但是DGAT1的抑制劑作為治療代謝性疾病和糖尿病的潛在藥物此前已有研究。在小鼠中，延長藥物抑制DGAT1和AZD7687的作用，可以與藥物抑制DGAT1小鼠產(chǎn)生相同的皮膚表型，包括皮脂腺萎縮和脫發(fā)。AZD7687對皮膚的介導(dǎo)有很強(qiáng)的時(shí)間依賴性，并且是可逆的，它們僅在持續(xù)的DGAT1抑制時(shí)發(fā)生；長期使用AZD7687對狗進(jìn)行治療時(shí)也會致使皮脂腺發(fā)生萎縮，但不會導(dǎo)致更加嚴(yán)重的脫毛現(xiàn)象。盡管給人類使用的治療劑量和給小鼠使用的治療劑量對皮膚產(chǎn)生的影響可能有所不同，但在使用DGAT1抑制劑的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測皮膚變化的工作依然十分重要。

綿羊脫毛癥主要受環(huán)境因素和基因因素共同影響，本研究主要從基因的因素分析脫毛癥的原因。在綿羊1號染色體上的遺傳信息量大，存在大量與皮膚、毛囊、生長發(fā)育相關(guān)的基因，具有經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的QTL有35個(gè)。因此，本論文選擇1號染色體作為研究對象，對其上的SNPs進(jìn)行分析，獲得相關(guān)的分子標(biāo)記。通過基因注釋找出脫毛癥有關(guān)的候選基因，在選擇選育中控制與減少脫毛癥的發(fā)病率，對預(yù)防和治療羊的脫毛癥具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在伊犁庫克圖拜種畜場，隨機(jī)挑選150只中國美利奴羊，分為病例組（50只）和健康組（100只）。樣品病理情況調(diào)查時(shí)間為2006~2016年。

1.2 耳組織采集

用剪耳鉗在耳緣處剪下一黃豆大小的組織塊，去除掉組織塊上的毛和雜物，置于已滅菌的1.5 mL離心管中，編號后放入采樣冰盒，送往實(shí)驗(yàn)室，保存于-70 ℃的冰箱中備用。

1.3 樣品DNA提取

粉碎耳組織，加入2 mL裂解液，搖勻10 min；取出混合液冷卻至常溫，并向滅菌離心管加入600 μL Tris-HCl飽和酚溶液，將上下輕柔顛倒混勻10 min，于2000 r/min下離心10 min；用剪刀將1 mL槍頭尖部剪為直徑大小約0.3 cm的圓形，取出600 μL上清液移至新的滅菌離心管，加入1∶1的酚/氯仿溶液600 μL，輕柔搖勻5 min，于2000 r/min下離心10 min；將上層液移至新的滅菌離心管中，加入600 μL氯仿溶液，輕搖5 min后，于2000 r/min下離心10 min；加入冰無水乙醇1 mL，輕搖2 min，可觀察到的絮狀物即為DNA，于2000 r/min下離心10 min；將TE（pH值7.0）溶液加入滅菌離心管，彈起混勻干燥的DNA，保存于4 ℃冰箱中，直至DNA完全溶解。

1.4 送至生物公司制備芯片及其結(jié)果的處理

由生物公司進(jìn)行Illumina Ovine SNP50 Bead-Chip制備，再由BeadScan Software軟件將圖像進(jìn)行轉(zhuǎn)換，形成數(shù)據(jù)信號，然后再利用Genome Studio軟件對基本的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理，可以得到能用來運(yùn)算的VCF文件，經(jīng)過PLINK 1.07軟件將其轉(zhuǎn)換為MAP和PED文件。

1.5 基因型檢測

篩選生物技術(shù)公司提供的數(shù)據(jù)和SNP等位基因頻率分析，舍棄非目標(biāo)SNPs位點(diǎn)。用PLINK 1.07軟件對其進(jìn)行質(zhì)量控制：排除樣品中檢出率低于95%的單體樣品。同時(shí)，排除質(zhì)量不合格的SNPs，檢出率低于90%、最小等位基因頻率低于5%、哈代—溫伯格平衡檢驗(yàn)P值低于1×10-6的SNPs。

1.6 Fst的計(jì)算

本研究中，根據(jù)無偏估計(jì)Fst方法計(jì)算留下的SNP位點(diǎn)，獲得2個(gè)群體的每個(gè)SNP位點(diǎn)的群體分化指數(shù)Fst值［10］。計(jì)算公式如下：

其中，MSG為檢測的群體內(nèi)部位點(diǎn)的誤差均方：

MSP是檢測的群體之間位點(diǎn)的均方差：

nc為校正后的群體間平均樣本大小：

上述公式中，i是總亞群數(shù)S的一個(gè)群體，i=1，2，3，…，S；PAi是第i個(gè)亞群中SNP等位基因A的頻率； ni是亞群體i的平均樣本大小是各群體中PA的加權(quán)平均值，即

本研究的Fst數(shù)據(jù)計(jì)算基于（http：//www.r-project.org/）R語言pegas軟件包完成，畫圖基于R語言ggplot軟件包完成。

2 結(jié)果與分析

用分光光度計(jì)檢測所提取的耳組織DNA的濃度和純度，濃度大于50 ng/μL，純度OD260/OD280在1.7~2.0之間，OD260/OD230應(yīng)介于1.8~2.1之間。用0.8%瓊脂糖凝膠，驗(yàn)證所提取的耳組織基因組DNA。如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶清晰帶型完整，點(diǎn)樣孔干凈、無污染、沒有拖尾現(xiàn)象。可以說明所作電泳檢測的DNA沒有被蛋白質(zhì)污染、未發(fā)生降解，其檢測質(zhì)量合格，滿足高密度基因組芯片制備的條件。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2中，橫軸代表26對常染色體，其圖中點(diǎn)的密度大小代表攜帶遺傳信息的多少；縱軸代表Fst值，其高度表示對應(yīng)染色體上該位點(diǎn)表達(dá)的顯著程度。閾值線為研究參考線，閾值線上方區(qū)域?yàn)閷ρ芯坑幸饬x的位點(diǎn)，閾值線下方區(qū)域?yàn)樯釛壩稽c(diǎn)。

圖2 健康和脫毛癥綿羊全基因組分化系數(shù)分析（Fst）曼哈頓圖及OAR1上Fst值分布情況

對健康組和病例組進(jìn)行遺傳分化系數(shù)分析（表1），在1號染色體取前1%的分子標(biāo)記35個(gè)，在這些分子標(biāo)記附近的基因53個(gè)基因，其中有5個(gè)基因在基因組上沒有被注釋。其中影響皮膚發(fā)育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道SSBP3與脫毛癥相關(guān)（表2）。

表1 在2號染色體上健康和脫毛癥綿羊全基因組選擇信號分析（Fst≥0.251495）

表2 脫毛癥相關(guān)候選基因及其主要功能

3 討論

本論文通過對健康組和病例組進(jìn)行選擇信號分析，通過生物軟件提取1號染色體，對其進(jìn)行遺傳分化系數(shù)分析，獲取前1%的SNPs作為分子標(biāo)記，經(jīng)過基因注釋獲得相關(guān)基因53個(gè)，其中和皮膚毛囊發(fā)育相關(guān)的基因有4個(gè)，分別是GADD45A、GADD45A、MLPH、SSBP3，已報(bào)道與脫毛癥相關(guān)的基因是SSBP3。

GADD45A（Growth arrest and DNA damage inducible alpha）位于綿羊1號染色體45511896~45515027 bp范圍內(nèi)，屬于GADD45A基因家族，是DNA損傷修復(fù)的重要基因，該基因是抵抗誘導(dǎo)紫外線照射腫瘤的關(guān)鍵基因，在細(xì)胞增殖上使GADD45A沉默，能通過p53信號通路。在小鼠上利用通過RT-qPCR測定mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GADD45A沉默，使得腫瘤通過皮膚SCC中的p53信號通路促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，并減少凋亡、衰老。而經(jīng)過輻射引起的繼發(fā)性損傷的潛在機(jī)制可能有助于新型靶向藥物的開發(fā)，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，GADD45A是一個(gè)受輻射和光照在皮膚中上調(diào)的基因，GADD45A可能抑制上皮細(xì)胞的遷移和增殖。進(jìn)一步信號通路分析表明，GADD45A過表達(dá)能抑制AKT（蛋白激酶B，PKB）及其P38和JNK磷酸化［11］。

MCCC1（Methylcrotonoyl-CoA carboxylase 1）位于綿羊1號染色體上222513107~222566511 bp之間，該基因編碼3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶的大亞基可以起到異二聚體的作用。這個(gè)基因發(fā)生突變可能與3-甲基巴豆酰甘氨酸尿癥有關(guān)，降低綿羊的免疫力，從而更多地引發(fā)疾病，該基因涉及糖酵解、TCA循環(huán)、OXPHOS、糖異生、β-氧化和支鏈脂肪酸代謝等，并且參與皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化反應(yīng)、破壞穩(wěn)態(tài)環(huán)境，這些都已通過線粒體功能分析得到了證實(shí)［12］。

黑素親和素MLPH（Melanophilin）位于綿羊一號染色體上范圍在3540879~3587459 bp之間。家畜不同的被毛顏色與黑色素沉著的種類和數(shù)量有關(guān)系，黑色素的生產(chǎn)決定被毛顏色的深淺程度。MLPH會影響黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得家畜毛色發(fā)生改變，MLPH基因能使家畜毛色素稀釋，從而改變毛色［13］。

有些狗的皮毛顏色較淺，例如銀灰色、沙色、棕色等。這些不同的毛色會隨著色素基因表達(dá)而被稀釋，最后會出現(xiàn)脫發(fā)和皮膚炎癥，形成顏色稀釋脫發(fā)癥（CDA）［14］。CDA是以逐漸脫發(fā)為特征，反復(fù)被細(xì)菌感染次級毛囊形成毛囊炎。黑素體聚集在表皮和毛囊的黑素細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致毛發(fā)中的大黑素體和皮膚出現(xiàn)明顯的干燥［15］。

SSBP3（Single Stranded DNA Binding Protein 3）位于綿羊一號染色體上范圍在30346126~30511575 bp之間。該基因在角質(zhì)形成細(xì)胞分化中具有重要作用，角質(zhì)形成細(xì)胞中的SSBP3過度表達(dá)會導(dǎo)致表皮分化相關(guān)基因的活性顯著增加。SSBP3在角質(zhì)形成細(xì)胞分化中具有重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞中的SSBP3過表達(dá)會顯著增加與表皮分化有關(guān)基因的表達(dá)程度和活性；相反，SSBP3的低表達(dá)會降低表皮分化有關(guān)基因的表達(dá)程度和活性。此外，銀屑病和特應(yīng)性皮炎是由表皮分化和皮膚脫水引起的皮膚病，在基因上表現(xiàn)為SSBP3的表達(dá)水平下降。這些結(jié)果表明，SSBP3可能通過積極調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的方式與個(gè)體的水合皮膚表型相關(guān)聯(lián)［16］。

由于SSBP3的表達(dá)程度會影響與表皮分化有關(guān)基因的表達(dá)程度和活性，受影響的基因會在一定程度上影響表皮分化，推測可能使毛囊的形成與發(fā)育受到抑制，從而導(dǎo)致脫毛。此外，銀屑病和特應(yīng)性皮炎是由表皮分化和皮膚脫水引起的皮膚病，在基因上表現(xiàn)為SSBP3的表達(dá)程度下降。而近年有報(bào)道稱銀屑病會伴發(fā)瘢痕性脫發(fā)［17］，據(jù)此認(rèn)為SSBP3的低表達(dá)可能會引起脫毛癥。故將SSBP3列為羊脫毛癥的候選基因。

4 結(jié)論

通過遺傳分化系數(shù)（Fst）分析，在OAR1中獲得分子標(biāo)記35個(gè)，在這些分子標(biāo)記附近的53個(gè)基因，其中有5個(gè)基因在基因組上沒有被注釋。其中影響皮膚發(fā)育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道SSBP3與脫毛癥相關(guān)。對獲得的分子標(biāo)記可以為綿羊分子選育提供參考，可以縮短世代間隔和育種年限、節(jié)約成本，最終獲得免疫力強(qiáng)的健康綿羊，防止綿羊脫毛癥的出現(xiàn)，從而減少農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)損失。