STM LT2 Hfq與sRNA GcvB對靶基因OppA的調控作用

段世宇，潘 永，楊 陽，張家莉，楊 琦,3*，周碧君,3*

（1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

STM是沙門菌的一個重要血清型，是引起人畜胃腸炎的一種主要病原菌，其感染發病率居沙門菌感染的首位，約占食源性沙門菌感染的50%～70%［1］。近些年來，高通量技術進步使得sRNA出現，代表了原核生物中最重要的轉錄后調節劑類別。sRNA的長度在50~200個核苷酸（nt）之間，大多數sRNA具有多個靶標，通過與靶標信使RNA（mRNA）堿基配對起作用［2］。小調節RNA（sRNA）作為轉錄后調節因子，可以調節基因表達的多個方面，如轉錄、翻譯、mRNA穩定性和DNA維持或沉默［3］。Hfq是大多數細菌中普遍存在的Sm樣RNA結合蛋白，最明顯的功能是作為RNA匹配器的作用，可促進sRNA與其mRNA靶標之間的堿基配對，也可直接結合、調節某些mRNA的翻譯［4］。

STM和大腸桿菌一樣，在大量與伴侶蛋白Hfq和sRNA相關的研究中被用作模式菌株［5］。一直以來STM中有關伴侶蛋白Hfq依賴性sRNA GcvB轉錄后調控其靶基因作用機理的研究是學者們的主要研究熱點，而關于STM Hfq與GcvB靶基因作用的研究相對較少。在大腸桿菌中，已證明Hfq可獨立于sRNA調控靶mRNA表達［6］。二肽或氨基酸轉運蛋白OppA作為STM較為重要的蛋白分子，當STM處于營養較為豐富的環境中時，STM sRNA GcvB可在伴侶蛋白Hfq的協助下直接抑制其表達［7-8］。此前研究已證明STM OppA mRNA受GcvB直接調控且具體的作用位點已被闡明，而當GcvB不存在時，Hfq是否擁有對其獨立調控的能力，目前為止，尚未有相關研究闡明［9］。鑒于OppA基因在STM中的蛋白水平較高，有利于后續的蛋白水平檢測，本研究將利用λ-Red同源重組酶和FLP重組酶介導的DNA重組技術構建STM OppA::lacZ基因融合菌株，運用噬菌體轉導技術構建相應的Hfq或GcvB基因的完整缺失，通過qRT-PCR和β-半乳糖苷酶試驗分別檢測OppA基因轉錄和蛋白水平，判斷Hfq是否可獨立于GcvB調控OppA mRNA，為后續STM Hfq與OppA mRNA的作用機制探究提供理論和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與質粒

MA3409菌株（STM LT2 wild type）、MA7455菌株（STM LT2/pKD46）、MA10241菌株（STM LT2 ΔGcvB::cat）、MA10675菌株（STM LT2 ΔHfq::tetRA）、P22噬菌體、pKD13質粒、pCP20質粒及pCE40質粒均由法國國家科學研究中心（CNRS）分子遺傳學Bossi實驗室惠贈。

1.2 主要試劑

氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鹽酸四環素、利福平、Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase、dNTPs Mix 及ONPG均購自北京索萊寶科技有限公司。甲苯申請并報備于貴州大學實驗室與設備管 理 處。DL2000 Plus DNA Marker、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Cycle-Pure Kit和Bacterial RNA Kit （R6950）購自Omega生物科技有限公司。NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （gDNA Purge）購自近岸蛋白生物科技有限公司。

2 方法

2.1 引物設計與合成

登錄NCBI網站獲取STM LT2菌株的全基因序列（GeneID：AE006468.2），根據基因序列設計引物，引物由Primer select軟件設計并由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物列表

2.2 OppA::lacZ基因融合菌株的構建

以P1/P2為引物，pKD13為模板，PCR擴增用于與OppA基因部分編碼區替換的目的片段，利用λ-Red同源重組技術及FLP重組酶系統，將編碼半乳糖苷酶的lacZ基因克隆至STM LT2 OppA基因編碼區，使lacZ基因伴隨OppA基因的轉錄和翻譯表達。

2.3 P22噬菌體的轉導

通過噬菌體轉導技術，將MA10675菌株中替換Hfq完整基因序列的四環素片段和MA10241菌株中替換GcvB完整基因序列的氯霉素片段分別或同時轉導至STM LT2 OppA::lacZ菌株。

2.4 Touch-down PCR反應及瓊脂糖凝膠電泳試驗

上述涉及重組菌株的構建與鑒定的PCR反應均采用Touch-down PCR反應程序：95 ℃、6 min；95℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、90 s，5個循環；95 ℃、10 s，53 ℃、30 s，72 ℃、90 s，20個循環；72 ℃、8 min。結束后分別取以同一菌株總DNA為模板不同引物擴增的產物10 μL混合于200 μL PCR管，取20 μL混合產物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。

2.5 qRT-PCR反應

根據Omega公司生產的Bacterial RNA Kit （R6950）試劑盒提取相應細菌的總RNA樣本，再使用近岸蛋白質科技有限公司生產的NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA。

普通PCR對熒光定量PCR引物P12/P13（OppA基因）和 P14/P15（16 S rDNA基因）進行特異性檢測，反應程序為：95 ℃、6 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，20個循環；72℃、1 min。取擴增產物10 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

以制備的cDNA為模板，進行qPCR擴增反應，檢測不同菌株OppA基因轉錄水平。反應體系為：AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL；cDNA（200 ng/μL） 2.0 μL；上游引物（10 μM）0.5 μL；下游引物（10 μM） 0.5 μL；ddH2O 2.0 μL。反應程序為：95℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環。每組設3個重復，以16 S rDNA為內參基因，以STM LT2 OppA::lacZ菌株為對照。最終采用相對比較法，即ΔΔCT法（Qr=2-ΔΔCt）計算分析數據［10］。

2.6 β-半乳糖苷酶活性的檢測

參考Griffith等［11］的方法，檢測lacZ基因表達的β-半乳糖苷酶活性，每組設3個重復并設STM LT2 OppA::lacZ菌株為陰性對照，同時設空白對照。將lacZ基因融合菌株過夜培養復蘇，次日取100 μL到新的LB中培養至對數期（OD600nm≈0.5），取0.1 mL菌液至一個新的試管，加0.9 mL的Z buffer，對照組加1 mL的Z buffer，向試管中等量滴加1~3滴甲苯，立即旋轉振蕩30 s，然后放到42 ℃水浴搖床震蕩2~3 h，再置于28 ℃水浴5 min后加入100 μL ONPG（8 mg/mL）并記錄時間為t1，待溶液變黃，立即加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3終止液并記錄時間為t2。將試管中終止所得液體進行一次離心，取上清液 1 mL置于比色皿中，以Z buffer作為空白對照，測OD420，記錄數值。按公式（1000×OD420/ （t2- t1）×0.1×OD600）計算β-半乳糖苷酶活性。

3 結果

3.1 STM LT2 OppA::lacZ菌株的構建結果

利用λ-Red同源重組酶及FLP重組酶系統，構建STM LT2 OppA基因和lacZ基因融合菌株。PCR鑒定結果顯示，STM LT2 OppA::kn、STM LT2 OppA::scar和STM LT2 OppA::lacZ重 組 菌 株 均出現了與預期大小相符的目的條帶。測序結果顯示，STM LT2 OppA::kn、STM LT2 OppA::scar和STM LT2 OppA::lacZ重組菌株目的條帶大小分別為892 bp（P1/P2）、1050 bp（P3/ P4）和 250 bp（P6/P7），與預期大小完全相符（圖1）。測序峰圖顯示，lacZ基因已成功與OppA基因融合重組（圖2）。麥康凱固體培養基結果顯示，與野生型菌株MA3409相比，STM LT2 OppA::lacZ重組菌株呈現紅色菌落（圖3），具備發酵乳糖產酸的能力。以上結果表明，STM LT2 OppA基因和lacZ基因的融合菌株已正確構建。

圖1 重組菌株的PCR電泳結果

圖2 測序峰圖

圖3 麥康凱鑒別培養基生長情況

3.2 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB和Hfq單基因及雙基因缺失菌株的構建結果

以STM LT2 OppA::lacZ菌株為受體菌，MA10241或MA10675為供體菌，利用P22噬菌體轉導技術構建STM LT2 OppA::lacZ菌株gcvB基因缺失、Hfq基因缺失以及GcvB和Hfq基因雙缺失菌株。PCR鑒定結果顯示，STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat、STM LT2 OppA::lacZ ΔHfq::tetRA和STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat ΔHfq::tetRA菌株均出現了與預期相符的目的條帶。測序結果顯示，STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat菌株目的條帶大小分別為696 bp（P8/P9）和250 bp（P6/P7）；STM LT2 OppA::lacZ ΔHfq::tetRA菌株目的條帶大小分別為1964 bp（P10/P11）和250 bp（P6/P7）；STM LT2 OppA::lacZ ΔGcvB::cat ΔHfq::tetRA菌株目的條帶大小分別為1964 bp（P10/P11）、696 bp（P8/P9）和250 bp（P6/P7），與預期大小完全相符（圖4）。結果表明，STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB基因缺失、Hfq基因缺失以及GcvB和Hfq基因雙缺失菌株已正確構建。

圖4 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB、Hfq基因單缺失及雙缺失后PCR電泳結果

3.3 GcvB和Hfq基因單缺失和雙缺失對OppA基因轉錄水平的影響

對OppA和16 S rDNA基因的熒光定量PCR引物特異性進行檢測。PCR鑒定結果顯示，所有目的條帶單一，無雜帶及引物二聚體（圖5）。測序結果顯示，目的條帶大小分別為153 bp（P12/P13）和133 bp（P14/P15），與預期目的條帶大小完全相符（圖5）。結果表明，OppA和16 S rDNA熒光定量PCR引物均滿足試驗要求。

qRT-PCR檢測結果顯示，與WT相比，缺失GcvB基因使OppA基因轉錄水平上調4.4倍（圖5）；缺失Hfq基因使OppA基因轉錄水平上調6.5倍（圖6）；GcvB和Hfq雙基因缺失使OppA基因轉錄水平上調6.8倍（圖6）。結果表明，Hfq和GcvB對OppA轉錄水平具有負調控作用。

圖5 引物特異性PCR電泳結果

圖6 STM LT2 OppA::lacZ菌株GcvB、Hfq基因單缺失或雙缺失后OppA基因轉錄水平的qRT-PCR檢測結果

3.4 GcvB和Hfq基因單缺失和雙缺失對OppA基因蛋白水平的影響

測定OppA::lacZ基因融合菌株β-半乳糖苷酶活性。結果顯示，與WT相比，敲除GcvB基因使OppA蛋白水平上調5.4倍（圖7）；敲除Hfq基因使OppA蛋白水平上調6.0倍（圖7）；同時敲除GcvB和Hfq基因使OppA蛋白水平上調了8.3倍（圖7）。結果表明，Hfq和GcvB均對OppA蛋白水平具有負調控作用。

圖7 重組菌株β-半乳糖苷酶測定結果

4 討論

Hfq在細菌 RNA代謝中起著多種作用。這些作用包括通過促進mRNA的多聚腺苷酸化使mRNA不穩定［12］、穩定小調節RNA （sRNA）以防止sRNA降解［13］、不依賴ATP可促進 sRNA與mRNA堿基配對［14］，Hfq還可以直接結合某些mRNA并調節它們的翻譯［15-16］。沙門氏菌中大量基因的表達受Hfq影響，hfq突變體使許多蛋白發生顯著的變化，其中包括 OMP，如OmpD、鞭毛蛋白FliC和許多周質蛋白，周質蛋白是鼠傷寒沙門氏菌的寡肽轉運系統中不可缺少的功能蛋白，OppA基因編碼的蛋白質是周質中最豐富的蛋白質之一［17］。Alexandra Sittka等［18］研究發現Hfq的缺失影響了周質蛋白群體的組成，確定了Hfq對ompD mRNA有極強的親和力。鑒于Hfq最近作為一種小RNA結合蛋白受到了廣泛關注［19］，Hfq缺失使周質蛋白的改變也讓人感興趣。并且Hfq及GcvB對OppA基因作用的分子機制仍然未知。本研究旨在探索Hfq及GcvB對OppA基因的作用機制。

20世紀80年代，Norton等［20］將大腸桿菌表達β-半乳糖苷酶的lacZ基因與勞斯肉瘤病毒相應基因構建為融合質粒并與病毒一同轉染細胞，通過檢測β-半乳糖苷酶的表達活性可分析所研究基因的復制和表達特點。隨著科學技術的發展，lacZ基因的融合技術可直接被利用在染色體的某個基因上。20世紀初，Ellermeier等［21］利用FLP酶介導FRT位點特異性重組的特性，構建了針對lacZ基因靶向轉錄和翻譯融合的質粒pCE40。該質粒僅有一個FRT位點，位點后為已刪除5′UTR的lacZ基因，而pCE40將在FLP酶的作用下通過自身FRT位點與染色體上目標基因唯一的FRT位點融合，目標基因的FRT位點則最先通過λ-Red同源重組技術而整合到目標基因CDS區，完成融合的lacZ基因將與目標基因共用5′UTR，隨著目標基因轉錄而轉錄，翻譯而翻譯。本研究構建的OppA-lacZ基因融合菌株在麥康凱鑒別培養基上生長出明顯的紅色菌落，表明該菌株已成功構建，對OppA-lacZ基因融合菌株進行β-半乳糖苷酶活性的測定，即可分析OppA基因蛋白水平，更方便地代替了Western Blot試驗。

本實驗中，為明確Hfq與GcvB對其靶基因OppA調控的重要性，構建了Hfq和GcvB基因的單缺失和雙缺失菌株。結果顯示，OppA基因轉錄和蛋白水平與野生型菌株相比均出現了超過4倍的上調，說明伴侶Hfq和sRNA GcvB對OppA的表達均有重要的負調控作用。Pulvermacher等［22］對大腸桿菌Hfq和GcvB基因進行同樣的單缺失和雙缺失處理，通過測定堿性磷酸酶活性分析OppA基因蛋白水平，結果顯示：OppA基因蛋白水平與野生型菌株相比產生了超過4倍的上調變化，也證明了Hfq和GcvB調節OppA基因表達的重要性。Sharma等［9］通過體內體外實驗證實了沙門菌中GcvB靶向OppA mRNA核糖體結合位點內部和上游的富含C/A的序列來調節OppA mRNA的翻譯，而且Hfq對GcvB的穩定性顯得極為重要。大量關于Hfq的研究表明，Hfq在細菌中以六聚體形式存在，它的作用目前被認同的有3種：同時與sRNA和mRNA結合，改變sRNA與其靶mRNA的空間構象，促進退火；直接與靶mRNA關鍵位點結合，抑制或促進mRNA的翻譯；直接與sRNA關鍵位點結合，增強sRNA的穩定性，避免被核酸酶降解［23-25］。研究中發現：Hfq和GcvB基因雙缺失菌株OppA轉錄和蛋白水平均略高于單缺失菌株，說明Hfq和GcvB調控OppA mRNA的作用可能是疊加的，進而推測Hfq在不存在GcvB時，對OppA mRNA同樣可調節，若為直接作用則可能有關鍵結合位點，該關鍵結合位點有待進一步研究。本研究驗證了Hfq可獨立于GcvB對OppA基因進行調控，也驗證了Hfq及GcvB在STM TL2中在寡肽轉運系統功能域有作用。該研究擴大了蛋白Hfq的調節范圍。為進一步闡述Hfq及GcvB在STM LT2中的調控機制和功能奠定了基礎。