苦瓜苗期耐熱性綜合評價及其鑒定指標的篩選

陳中釤，杜文麗，許端祥，高 山*，林碧英

（1.福州市蔬菜科學研究所，福建 福州 350111；2.福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350002）

近年來，隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣頻發，高溫熱害已成為影響作物生長的一個重要環境因子［1］，苦瓜（Momordica charantia L.）性喜溫暖，較耐熱而不耐寒，但不同苦瓜種質資源耐熱能力差異明顯，對于育種工作者而言，快速、準確地開展苦瓜種質資源耐熱性的鑒定和評價，能有效地減少育種盲目性，提高育種效率，縮短育種周期。因此，開展苦瓜種質資源耐熱性鑒定和評價具有十分重要的意義。目前，已有學者從生理特性、農藝性狀等方面開展了苦瓜耐熱性的鑒定及評價指標的篩選等研究，郭培國等［2］研究表明，電解質滲透率、丙二醛含量、葉綠素含量、葉綠素熒光參數Fv/Fm等與耐熱性相關的生理指標可用于苦瓜耐熱性評價。鄭巖松［3］、李家明［4］等通過調查夏季高溫環境下苦瓜植株田間表現，篩選出與苦瓜耐熱性相關的農藝性狀指標。曾晶等［5］研究結果表明：產量、商品果數和單果重的變化率可作為苦瓜成株期耐熱性強弱的鑒定指標。

大多數學者認為，植物耐熱性的遺傳是由多對基因控制的數量性狀，且不同植物耐熱機制不同，相關研究表明，苦瓜苗期耐熱性的遺傳是受2對加性—顯性—上位性主基因控制［6］，因此僅通過單一指標無法準確地鑒定和評價苦瓜的耐熱性，需要從眾多指標中篩選出若干重要指標，建立可靠的數學模型進行耐熱性綜合評價，而綜合評價法是將主成分分析、隸屬函數分析和聚類分析這3種方法相結合，可綜合反映植物的耐熱能力，此方法已經在棉花［7］、黃瓜［8］、大白菜［9］、番茄［10］、茄子［11］等作物的耐熱性評價中廣泛應用，但針對苦瓜苗期耐熱性評價的研究鮮見報道。

本研究以20份苦瓜自交系為材料，測定高溫脅迫下苦瓜苗期13項生理生化和光合特性指標，采用多元統計分析方法開展了苦瓜的耐熱性綜合評價，并建立了苦瓜苗期耐熱性評價數學模型，以期為苦瓜種質資源耐熱性的鑒定和評價，以及為耐熱苦瓜新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為經多年田間觀察，耐熱性差異顯著的苦瓜高代自交系20份，均由福州市蔬菜科學研究所苦瓜課題組提供，20份苦瓜自交系的來源和主要形態、生物學特征參考《苦瓜種質資源描述規范和數據標準》［12］展開調查，調查結果見表1。

表1 各苦瓜自交系的來源、主要形態和生物學特征

1.2 試驗處理

將20份苦瓜自交系點播于50孔穴盤中，置于人工氣候室28 ℃恒溫催芽，待種子破土后，設置晝夜溫度28 ℃/18 ℃，光照強度5000 lx，光周期12 h，相對濕度為70%，待2片真葉展開時，移栽至直徑8 cm的營養缽內進行常規培養，培養基質配比為泥炭∶蛭石∶珍珠巖=7∶2∶1（v∶v∶v），培養環境同上，待苗長至3葉1心期時，選擇長勢一致的幼苗置于人工氣候室內38 ℃恒溫脅迫，設置光照強度5000 lx，光周期12 h，相對濕度為70%，每份材料8株，設3次重復，隨機區組排列，高溫脅迫72 h后進行相關參數測定，以常規培養（晝夜溫度28℃/18 ℃）72 h的苦瓜幼苗作對照。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生理指標的測定 參照李合生［13］的實驗方法，采用丙酮提取法測定葉綠素（Chl）含量、硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（MDA）含量、電導儀測定相對電導率（REC）、氮藍四唑法（NBT）測定超氧化物岐化酶（SOD）活性、愈創木酚顯色法測定過氧化物酶（POD）活性、紫外光吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性、磺基水楊酸提取法（SA）測定游離脯氨酸（Pro）含量、羥胺氧化法法測定超氧陰離子自由基（O2-·）含量、硫酸鈦比色法測定過氧化氫（H2O2）含量。

1.3.2 光合指標的測定 凈光合速率的測定：使用LI-6800型便攜式光合作用測定儀（美國LICOR公司）測定苦瓜葉片凈光合速率（Pn），選擇苦瓜植株從基部向上數第3片功能葉于早上9:00~11:00進行測量，每個材料測定3次，結果取平均值。

葉綠素熒光參數的測定：使用LI-6800型便攜式光合作用測定儀測定苦瓜葉片葉綠素熒光參數，測定前植株暗處理30 min，選擇苦瓜植株從基部向上數第3片功能葉進行測量，每個材料測定3次，結果取平均值，測定指標包括初始熒光（Fo）、最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ΦPSⅡ）。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據統計與分析，SPSS 22.0軟件進行相關分析、主成分分析與聚類分析。

耐熱系數（heat-tolerance coefficient，HTC）：

各綜合指標的隸屬函數值：

式（2）中，Xj表示第j個綜合指標值；Xmax表示第j個綜合指標的最大值，Xmin表示第j個綜合指標的最小值。

各綜合指標的權重：

式（3）中，Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的權重，Pj為各品種第j個綜合指標的貢獻率。

綜合耐熱性評價值：

式（4）中，D為不同苦瓜自交系在高溫脅迫下由綜合指標評價所得的耐熱性綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 各單項指標的耐熱系數及相關性分析

由表2可知，不同苦瓜自交系經高溫脅迫后，其POD、SOD、CAT、Pro、O2-·、H2O2與對照相比均不同程度上升（HTC＞1），而Chl、Pn、Fv/Fm、ΦPSⅡ與對照相比均不同程度下降（HTC＜1），MDA、REC、Fo在各材料間的耐熱系數表現不一致，有的上升，有的下降。從變異系數可以看出，CAT、H2O2變異系數排在第1位、第2位，分別為35.261%和33.959%，ΦPSⅡ的變異系數為14.259%，在所有13項指標中變異系數最小，表明高溫脅迫對苦瓜葉片的CAT、H2O2影響較大，對ΦPSⅡ的影響較小。由于同一材料不同單項指標以及同一指標不同材料的耐熱系數變化不盡相同，因此難以根據單一指標的耐熱系數判斷材料耐熱性強弱。

表2 不同苦瓜自交系的各項指標耐熱系數

相關分析結果表明（表3），各單項指標與其他指標間至少存在1個或多個顯著相關或極顯著相關，其中，抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT）兩兩之間呈極顯著正相關；光合指標（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）兩兩之間呈極顯著相關；MDA、Pro均與O2-·、H2O2呈極顯著正相關；REC與光合指標（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）呈極顯著正相關；Chl與REC、Pn、Fo、Fv/Fm呈極顯著相關；O2-·與H2O2呈極顯著正相關。由于各單項指標之間的耐熱系數存在不同程度的相關性，造成它們所提供的信息發生重疊，表明苦瓜耐熱性是一個復雜的綜合性狀，單一指標不能準確地評價苦瓜的耐熱性，因此，需要利用多元統計方法進行分析和評價。

表3 各單項指標的相關系數矩陣

2.2 主成分分析

對13個單項指標的耐熱系數進行主成分分析，選取特征值大于1的主成分，結果顯示，13個單項指標轉化成4個主成分（表4），貢獻率分別為44.735%、18.491%、14.553%、9.479%，累積貢獻率87.258%，表明這4個主成分能夠包含本試驗所有13個耐熱性評價指標的絕大部分信息。

表4 各性狀的主成分系數和貢獻率

從各項指標特征向量可以看出，第1主成分（CI1）貢獻率為44.735%，主要由Chl、REC、Pn、Fo、Fv/Fm構成，可稱為光合和相對電導率因子；第2主成分（CI2）貢獻率為18.491%，主要由MDA、O2-·、H2O2構成，可稱為活性氧和丙二醛因子；第3主成分（CI3）貢獻率為14.553%，主要由POD、SOD、CAT構成，可稱為抗氧化酶因子；第4主成分（CI4）貢獻率為9.479%，主要由Pro構成，可稱為脯氨酸因子。

2.3 綜合評價

2.3.1 隸屬函數分析 根據公式（2）分別計算20個苦瓜自交系4個綜合指標的隸屬函數值（表5），隸屬函數值的范圍在同一綜合指標中介于0.000~1.000之間，如果某一材料隸屬函數值為0.000，表明該材料在對應的綜合指標中耐熱性表現最弱，如果其隸屬函數值為1.000，表明該材料在對應的綜合指標中耐熱性表現最強。由表5可知，T9、T13、T14、T19分別對應綜合指標u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隸屬函數值為1.000，表明其在對應的綜合指標耐熱性表現最強，而T19、T5、T19、T8分別對應綜合指標u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隸屬函數值為0.000，表明其在對應的綜合指標耐熱性表現最弱。

2.3.2 權重確定 將4個綜合指標的貢獻率代入公式（3）中計算得到4個綜合指標的權重分別為0.513、0.212、0.167、0.109（表5）。

2.3.3 綜合評價 運用公式（4）計算各苦瓜自交系綜合耐熱評價值D（表5），并根據D值的大小對各材料耐熱性強弱進行排序。結果表明，20個苦瓜自交系耐熱性由強到弱排序依次為T9＞T13＞T10＞T17＞T14＞T8＞T7＞T4＞T16＞T11＞T2＞T6＞T15＞T12＞T 18＞T3＞T1＞T19＞T20＞T5。

表5 各苦瓜自交系的綜合指標值、權重、u（Xj）、D值和綜合評價

2.4 不同苦瓜自交系耐熱性的聚類分析

采用歐氏距離，離差平方和法對各苦瓜自交系的綜合耐熱評價值（D值）進行聚類分析（圖1），在綜合評價值距離為6.1的位置，將20個苦瓜自交系根據耐熱能力強弱劃分為3類。第Ⅰ類為強耐熱型，共5個材料，分別為T9、T10、T13、T14、T17；第Ⅱ類為中耐熱型，共14個材料，分別為T1、T2、T3、T4、T6、T7、T8、T11、T12、T15、T16、T18、T19、T20；T5歸為第Ⅲ類，屬于弱耐熱型材料。

圖1 20個苦瓜自交系的D值聚類圖

2.5 逐步回歸分析及耐熱性鑒定指標的選擇

為進一步分析各指標與耐熱性之間的關系，篩選苦瓜苗期耐熱性鑒定指標，分別以各單項指標的耐熱系數和耐熱性綜合評價值作為自變量和因變量進行逐步回歸分析，獲得回歸方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352Chl+0.088MDA-0.149 REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，方程決定系數R2=0.991。由回歸方程可知，13個單項指標中有6個指標對苦瓜苗期耐熱性有顯著影響，分別是SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm，將這6個指標的耐熱系數代入回歸方程中對各苦瓜自交系耐熱性進行預測，結果表明（表6），各苦瓜自交系D值估計精度均在93.04%以上，平均估計精度96.92%，表明該方程適用于苦瓜苗期耐熱性評價。

表6 回歸方程估計精度分析

3 討論

高溫是植物生長發育過程中最常遭受的環境脅迫因子之一［14］，植物在高溫脅迫下，其內部生理機制會發生一系列諸如細胞膜透性增大［15-16］，葉綠素降解［17］，活性氧含量增加［18-19］，抗氧化酶活性升高［20］，葉片光合作用受到抑制［21］等復雜的連鎖反應。國內外眾多學者已篩選出與植物耐熱性密切相關的眾多表型性狀、生理生化、光合特性等指標，但不同指標對高溫脅迫的響應程度不同，因此，需要運用多元分析方法對植物耐熱性進行綜合評價，建立準確、可靠的耐熱評價體系。

本研究通過因子分析將13個生理生化和光合特性指標轉換為4個新的彼此獨立的綜合指標，4個綜合指標累積貢獻率達87.258%，并進一步通過隸屬函數和聚類分析將20個參試材料，根據其耐熱能力的大小分為強耐熱、中耐熱、弱耐熱3種類型。5個強耐熱類型苦瓜自交系中，T9、T13、T10都來源廣東，T14、T17來源我國臺灣省，均是近年來收集的耐熱性表現突出的優良品種，經多代定向選擇而育成的穩定自交系，其中T9在田間表現為葉片厚、葉色深綠、在夏季高溫環境下生長勢強、坐果性好且生育期長，在南方地區能正常越夏；而弱耐熱類型苦瓜自交系T5來源重慶市，田間表現極早熟、連續坐果能力強，耐低溫不耐高溫，在夏季高溫環境下生長受阻、畸形瓜多、易早衰，定位為早春設施栽培材料。由此可見，本研究中各苦瓜自交系聚類分析結果與田間表現基本一致。

本研究通過逐步回歸分析建立了苦瓜苗期耐熱性評價回歸方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352 Chl+0.088MDA-0.149REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，平均估計精度為96.92%，表明該方程可用于苦瓜苗期耐熱性評價，從回歸方程中篩選出6個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項指標可替代本研究調查的13個生理生化指標，能運用于苦瓜種質資源耐熱性快速鑒定，從而提高苦瓜耐熱性鑒定效率。從各單項指標的耐熱系數（表2）可知，強耐熱型苦瓜自交系在高溫脅迫下Chl、Pro、Fv/Fm均維持在較高水平，而REC變化較小，推測強耐熱類型苦瓜自交系的幼苗葉片在高溫脅迫下通過積累更多的Pro，以調節細胞滲透壓，保護細胞膜結構免受高溫脅迫的影響，同時葉綠素合成受抑制程度較低，光合作用能維持在較高水平，這與郭培國［2］、毛靜［22］、吳震［23］等的研究結果相一致。

4 結論

本 研 究 篩 選 出SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm等6個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項指標，為苦瓜苗期耐熱性鑒定和評價提供了理論依據，但在苦瓜耐熱評價過程中仍需要綜合考慮田間農藝性狀、產量性狀等其他指標的影響，以提高綜合評價的準確性。篩選出T9、T10、T13、T14、T17等5個強耐熱類型苦瓜自交系，可作為耐熱苦瓜新品種選配的親本材料。