支氣管鏡在菌陰肺結核診斷中應用價值

王燕波 胡陽 宋寧 賈守杰 魏存樂 丁衛民

肺結核是嚴重影響人民身體健康的傳染性疾病，已成為嚴重的社會公共衛生問題[1]。肺結核(肺臟、氣管支氣管及胸膜結核)雖為臨床常見病、多發病，但因臨床上近幾年來對結核病的忽視，加之菌陰結核病大量存在，肺結核多被誤診誤治，明確診斷時多已為重癥結核[2]。支氣管鏡可以直接觀察氣道局部病變，并通過活檢、刷檢、沖洗、灌洗等，取得氣道肺標本，進行結核分枝桿菌病原學、病理學及分子生物學檢測，對肺結核尤其是菌陰結核確診，提供了幫助[3]。為探討支氣管鏡在菌陰肺結核臨床診斷價值，本次研究對我院862例菌陰肺結核患者，進行了回顧性分析，現報告如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2020年12月大同市第四人民醫院862例菌陰肺結核患者作為本次研究對象進行回顧性分析，其中男性332例，占比38.52%，女性530例，占比61.48%，患者年齡18～60歲，平均年齡(42.5±3.3)歲。本研究經醫院倫理委員會批準(批準號：2021003)，所有患者均簽署知情同意書。

菌陰肺結核診斷參考相關標準[4]：①典型肺結核臨床癥狀和胸部X線表現；②抗結核治療有效；③臨床可排除其他非結核性肺部疾患；④PPD(5iu)強陽性、血清結核抗體陽性；⑤痰結核分枝桿菌PCR +探針檢測陽性；⑥肺外組織病理證實結核病變；⑦BALF檢出抗酸菌；⑧支氣管或肺組織病理證實結核病變。具備1～6中3項，或7～8中任何一項可確診。除外氣管支氣管結核及結核性胸膜炎。

二、標本留取及檢測方法

1.標本留取：① 痰液留取：鏡檢前及鏡檢后當時囑患者進行深呼吸，并盡量收集其由肺部深處咳出分泌物。②電子支氣管鏡檢查及取樣：使用潘太克斯EB-1975K型及奧林巴斯290系列支氣管鏡進行支氣管鏡檢查。針對肺部病灶部位進行沖洗檢查，取得沖洗液標本。

2.檢測方法：沖洗液離心后分別行抗酸染色鏡檢找抗酸桿菌、結核分枝桿菌BD-960快速培養、羅氏培養及藥敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain等檢測[4]。

(1)抗酸染色

①初染：用玻片夾，夾持涂片標本，滴加石炭酸復紅2～3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發減少，應再加染液，以免干涸，加熱3～5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。②脫色：3%鹽酸酒精脫色30秒～1分鐘；用水沖洗。③復染：用堿性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。

(2)BD-960快速培養

標本接種前 ，在MGIT培養管中先加入 0.8mL MGIT PANTA /Growth Supplement(雜菌抑制劑 /生長添加劑)，再加入 0.5 mL處理后懸濁液，同時接種血平板(檢測是否污染)、直接涂片抗酸染色(以便陽性快速報告)，將培養管放入 BD BACTECTMMGITTM960儀。培養法嚴格按照 BD BACTECTMMGITTM960 系統操作說明書進行，培養時間設定為42d。儀器提示陽性結果，取培養液涂片用快速抗酸染色法進行確認。抗酸染色陽性的菌株用熒光PCR 技術鑒定是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。儀器提示陽性結果，涂片抗酸染色鏡檢未找到抗酸桿菌，將此分枝桿菌培養的標本接種在血平板、麥康凱平板、沙氏平板、真菌顯色平板，經37 ℃培養，有革蘭陰性桿菌或真菌生長，此情況為標本污染判為假陽性。所有接種和其他處理步驟都應在生物安全柜中進行，使用生物安全水平為 Ⅱ 級的接種方法、防護措施和設備。所有接種過的培養管等必須先經過高壓滅菌后再按醫療垃圾處理。

(3)羅氏培養及藥敏試驗

采集沖洗液標本，采取酸性改良羅氏培養基進行培養，培養后再進行藥敏試驗。采取NaOH(3%)前處理，3倍體積處理液置于無菌痰杯，沖洗液充分液化，于20 min內接種兩支羅氏培養基。再通過純菌按高低兩個藥物濃度做藥敏實驗；采用絕對濃度間接法，并設對照管和對硝基苯甲酸(PNB)，α-羧酸肼噻吩(TCH)進行菌型鑒定；所用藥敏濃度：異煙肼(H)分別為1和10μg/mL、利福平(R)分別為50和250μg/mL、鏈霉素(S)分別為20和200μg/mL、吡嗪酰胺(Z)分別為25和100μg/mL、乙胺丁醇(E)分別為5和50μg/mL、利福噴丁(RFT)為50和250μg/mL、對氨基水楊酸鈉(P)分別為1和10μg/mL、氧氟沙星(OFLX)分別為5和50μg/mL、丁胺卡那(AK)分別為10和100μg/mL、丙硫異煙胺(TH)分別為25和100μg/mL、對氨基水楊酸異煙肼(PI)分別為1和10μg/mL、卷曲霉素(C)分別為100和1000μg/mL。菌液濃度為10-2取0.1mL接種培養基上，(35±1)℃培養四周報告。

(4)PCR-TB-DNA

取無菌灌洗沖洗瓶采集每位研究對象支氣管肺泡沖洗液5 mL，密閉處理立即送檢，通過熒光定量PCR法進行檢測，標本內加入等體積NaOH(4%)混合搖勻，在室溫條件下放置30 min，取液化后標本1 mL置于離心管內，離心處理(12 000r/min，5 min)，去除上清液，置入1mL無菌生理鹽水，洗滌，離心處理(12000r/min，5 min)，放入核酸提取儀，通過最大轉速震蕩5 min，在95℃熱水中熱浴5 min，離心處理(5000 r/min，1 min)，取上清液，通過博奧生物集團有限公司結核分酸檢測試劑盒操作執行。

三、結核桿菌培養

(1)X-pert

取痰液標本加入2 mL處理液內，置于渦旋振蕩器上混合均勻孵育15 min，取處理液加入反應盒內，置于GeneX-pert檢測模塊內，2 h后判斷檢測結果。

(2)Hain檢測

指導患者深吸氣后用力咳出氣管深處痰液置于培養瓶內，依據中國防癆協會基礎專業委員會制定的《結核病診斷實驗室檢驗規程》中相關標準對痰標本實施接種培養，將接種后痰標本消化液采取Geno Type MTBDRplus檢測試劑盒(德國Hain MTBDRplus公司)進行檢測。

四、觀察指標

對比862例菌陰肺結核患者在不同方法下抗酸桿菌及結核分枝桿菌的相關檢測情況(見表1)。

表1 862例患者不同方法分枝桿菌相關檢測情況[n(%)]

五、統計學分析

采用SPSS20.0軟件進行數據處理，計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

兩組患者不同方法抗酸桿菌及結核分枝桿菌相關檢測情況，如(表2)所示：支氣管鏡檢前后痰液及沖洗液標本抗酸染色陽性率分別為0.00 %(0/862)、6.15 % (53/862)及 12.18%(105/862)，三者之間有顯著性差異(P<0.05)；沖洗液BD-960快速培養、羅氏培養及藥敏、PCR-TB-DNA、X-pert及Hain檢測陽性率分別為：25.17 %(217/862)、26.57%(229/862)、42.69%(368/862)、52.32%(451/862)及47.45%(409/862)，分別與鏡檢前傳統痰涂片抗酸桿菌陽性率比較均有顯著性差異(P<0.05)；支氣管沖洗液抗酸染色聯合BD-960快速培養、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及羅氏培養陽性率高達65.89%(568/862)，分別與鏡檢前后傳統痰涂片抗酸桿菌陽性率比較均有顯著性差異(P<0.05)。支氣管沖洗液抗酸染色聯合BD-960快速培養、羅氏培養陽性率為(33.76%，291/862)低于支氣管沖洗液PCR-TB-DNA、X-pert、Hain陽性率(59.19%，509/862)。差異具有統計學意義。其中，451例沖洗液Xpert陽性的標本中，存在rpoB基因突變的有83例，突變率為18.40%；409例沖洗液Hain陽性的標本中，檢測到異煙肼耐藥的有79例，突變率為19.32%(見表3)。

表2 862例患者結核分枝桿菌病原學與分子生物學檢測陽性率比較

表3 X-pert及Hain陽性患者基因突變情況[n(%)]

討 論

結核病作為一種慢性傳染疾病，嚴重的影響著人們的身體健康和生活質量水平，我國是結核病發病率較高國家之一[5]。早發現、早診斷、早治療是控制結核病、阻斷結核病傳播的重要措施。有研究表明[6]，菌陰肺結核患者占所有肺結核患者的60%，如果痰菌陰性肺結核患者不能得到有效的治療，會進一步發展成為痰菌陽性肺結核疾病，從而造成更多的人群患上肺結核疾病。以往臨床上對該疾病的認識不全、檢查手段的局限性，導致臨床上大量漏診、誤診的現象發生，因此如何有效的對結核患者進行疾病的確診具有十分重要的臨床意義[7]。

當前臨床多通過痰涂片和痰培養診斷肺結核，具有操作簡單等優勢，但敏感性與特異性較低。而電子支氣管鏡檢查不僅能夠直觀的觀察氣道黏膜情況，且能夠通過對肺部病灶所在的支氣管進行肺泡沖洗、支氣管沖洗等檢查，聯合相關檢測能提高肺結核的診斷率。其中肺泡沖洗可有效的增加對病灶的接觸面，同時生理鹽水的注入還會對支氣管產生一定的刺激性，導致患者出現不同程度的咳嗽，可能會讓深部結核桿菌被咳出得以回收，從而提高沖洗液相關檢測的陽性率[8]。本研究，支氣管鏡檢查前痰涂片抗酸染色陽性率為0%，通過支氣管鏡檢查等刺激后，鏡檢后痰涂片抗酸染色陽性率明顯升高，而支氣管鏡沖洗檢查陽性率更高(12.18%)，沖洗與既往國內外相關研究結論相一致[9-10]。此外，通過肺泡沖洗液進行抗酸染色檢查、PCR、X-pert、Hain等綜合診斷，可將陽性率提高至65.89%，顯著高于普通痰涂片檢查(P<0.001)，提示支氣管鏡檢查聯合檢測方式，可提高菌陰肺結核確診率。本研究還發現，所有分子檢測手段(PCR、X-pert、Hain)綜合陽性率顯著高于所有病原學檢測綜合(抗酸染色、快培、羅培)。同時結合X-pert及Hain檢測陽性患者中突變的檢出情況，顯示分子檢測手段在結核病的診斷甚至治療中，起到了更加重要的作用，因此應重視分子檢測手段在結核病特別是菌陰肺結核中的應用價值，應積極加以推廣。

菌陰肺結核診斷率不高的因素有很多，其中不僅與肺結核患者的病變類型，如血行播散型肺結核等，還與痰標本留取、運輸，甚至檢測人員的技術等，甚至與肺結核不同檢測技術本身的局限性等均有關。通過將上述不同因素進行完善改進，同時利用本研究中支氣管鏡診斷技術同時聯合多種不同檢測方式，可明顯提高菌陰肺結核患者的診斷率。因此支氣管鏡技術應在肺結核特別是菌陰肺結核的臨床診療過程中積極推廣。

綜上所述，采用電子支氣管鏡肺泡沖洗檢查聯合抗酸染色，聯合BD-960快速培養、PCR-TB-DNA、X-pert、Hain及羅氏培養檢測能夠明顯提升菌陰肺結核患者的陽性檢出率，對提高菌陰肺結核診斷具有十分重要的臨床應用價值。