黃連生物堿改善心力衰竭的網絡藥理學機制研究*

劉卓超，黃小靖，曾志聰

1 深圳市中醫院,廣州 深圳 518000；2 深圳市中西醫結合醫院；3 廣州中醫藥大學附屬寶安中醫院

心力衰竭是多種原因導致心臟結構和/或功能的異常，使心室收縮和/或舒張功能發生障礙引起的一組復雜臨床綜合征，主要表現為呼吸困難、疲乏和液體潴留等［1］。根據流行病學研究［2］，我國人群的心衰患病率約為2%～3%，且隨著年齡的增長，患病率有上升的趨勢［3］，60歲以上患病率達到23%以上，嚴重影響人類健康。近年來研究［4-7］發現，黃連所含化學成分及其組方對心力衰竭具有治療作用，其中黃連生物堿是黃連起效的重要成分，其作用機制尚未明確，本研究基于網絡藥理學探討黃連生物堿治療心力衰竭的機制，為黃連生物堿藥理作用機制提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源本研究檢索數據庫包括：Uni-Prot（https：//www. uniprot. org/）、GeneCards（http：//www.gene-cards.org/）、String（http：//string-db.org/）、TTD（http：//bidd，nus，edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Metascape（http：//metascape.org/，Version 3.5）；軟件包括：Cytoscape 3.7.1及Venny 2.1。

1.2 研究方法

1.2.1 黃連生物堿的靶點篩選 TCMSP 是一個中草藥系統藥理學平臺，收錄了中藥、靶點和疾病之間的關聯信息，該數據庫包括化學成分、作用靶點和中藥靶點網絡，以及相關的藥物靶點-疾病網絡，以及關于口服生物利用度、藥物相似性、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動力學特性的信息。利用TCMSP 數據庫篩選中藥黃連的化學成分，并篩選出黃連生物堿的化學成分及相關靶點信息，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）為篩選條件，設置OB≥30%和DL≥0.18，篩選出符合條件的生物堿化合物。再檢索黃連生物堿的靶點，將獲取信息輸入UniProt 數據庫中檢索，篩選選擇“Reviewed”，選擇物種為“Human”，剔除非人源及未經驗證的靶點，最終檢索出黃連生物堿的基因靶點，通過Cytoscape 3.7.1 軟件構建中藥-成分靶點網絡圖。

1.2.2 心衰相關靶點的獲取 以“heart failure”為關鍵詞，檢索TTD、GENECARDS 數據庫中獲取心衰的相關疾病靶點。

1.2.3 黃連生物堿對心衰相關靶點的獲取 將“1.2.1”及“1.2.2”項下獲取的黃連生物堿作用靶點及心衰相關靶點的信息使用Venny 2.1 工具進行交集對比，所得的重復靶點將視為黃連生物堿作用于心衰的預測靶點，并繪制韋恩圖。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及拓撲學參數分析 將“1.2.3”項下映射到的靶點導入STRING數據庫，限定物種為“Homo sapiens”，設置置信系數為0.4，構建蛋白-蛋白相互作用網絡的PPI 網絡，導出網絡數據nodel1、nodel2 和Combined score，利用Cytoscape3.7.1 軟件構建PPI 網絡，利用“Network Analyzer”計算靶點蛋白互作網絡的拓撲學參數，參數如下：平均最短路徑（average shortest path length，ASPL）、介數中心性（betweenness centrality，BC）、中 心 接 近 度（closeness centrality，CC）、聚類系數（clustering coefficient，CC）、連通度（degree），設置節點大小與顏色反映連通度（degree）值大小，邊的粗細反映Combined score 大小，最終獲得蛋白質相互作用網絡。

1.2.5 通路富集分析 運用R3.6.1使用Bioconductor 提供的分析和理解高通量基因組數據的工具，完成GO 基因富集分析，并繪制條形圖，且進行KEGG通路分析，并繪制通路圖。

2 結果

2.1 黃連生物堿的靶點篩選通過檢索TCMSP數據庫，以OB≥30%和DL≥0.18 為檢索條件，從黃連中收集了6 個滿足條件的生物堿成分，分別為coptisine、berberrubine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine，見表1。檢索相關作用靶點，通過UniProt 的篩選及標準化，最終獲得79 個作用靶點，通過Cytoscape 3.7.1 構建中藥-成分靶點網絡，見圖1。

表1 黃連生物堿成分

圖1 中藥-成分靶點網絡圖

2.2 心衰相關靶點的獲取以“heart failure“為關鍵詞，經TTD 數據庫、GENECARDS 數據庫檢索，共獲取1614個結果。

2.3 黃連生物堿對心衰相關靶點的獲取將“2.1”與“2.2”獲取靶點通過Venny2.1 進行篩選，獲取其中與黃連生物堿靶點有20 個重合，其中包括ESR1、CSNK2A1、PTGS1、ATP5F1A、EGFR、IFNG 等，約占合計總數的1.1%，見圖2。

圖2 心衰相關靶點及黃連生物堿靶點的韋恩圖

2.4 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及拓撲學參數分析將20個重疊的靶點上傳String數據庫，獲取蛋白-蛋白相互作用網絡。將String 數據庫導出信息導入Cytoscape3.7.1 軟件中，重疊的靶點相互作用見圖3。重疊的靶點拓撲學分析，見表2。經Network Analyzer 分析網絡拓撲學分析發現，該蛋白互作網絡中節點數為16，邊緣數為31，聚類系數為0.610，見圖3。

表2 黃連生物堿對心衰作用靶點的拓撲學分析

圖3 蛋白-蛋白相互作用網絡圖

2.5 通路富集分析

2.5.1 GO 注釋分析 利用Metascape 的數據庫，將20 個重疊的靶點進行GO 富集分析，設置閾值P＜0.01，minimum count 3、enrichmentfactor＞1.5，得到靶點的通路信息，見圖4A—4B。GO 富集分析結果顯示：生物學過程（biological pro-cess，BP）分析其P≤0.01 共331 條，涉及血液循環、血壓調節、血管收縮、腺苷酸環化酶調節性G 蛋白偶聯受體信號通路、兒茶酚胺分泌的負調控、G 蛋白偶聯受體信號通路，兒茶酚胺轉運等，見圖5。細胞組件（cellular component，CC）分析P≤0.01 共有26 條，涉及基底外側質膜、膜筏、受體復合體、突觸膜的固有成分等，見圖6。分子功能（molecular function，MF）分析P≤0.01 共有21 條，兒茶酚胺結合、G 蛋白偶聯的胺受體活性、腎上腺素結合、神經遞質受體活性、鈣調蛋白結合等，見圖7。

圖4A 靶點的GO富集總分析

圖5 BP分析

圖6 CC分析

圖7 MF分析

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通過Metascape 平臺將篩選的黃連生物堿的活性靶點進行富集，得到靶點KEGG 通路信息，篩選出5 條直接與心力衰竭相關的信號通路，且對結果進行可視化，信號通路包括神經活性配體-受體相互作用（neuroacive ligand-receptor interaction）、鈣信號通路（calcium signaling pathway）、cGMP-PKG 信號通路（cGMP-PKG signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、cAMP 信號通路（cAMP signaling pathway）。見圖8。

圖8 KEGG富集分析圖

圖4B 靶點的GO富集總分析2

3 討論

本研究是通過數據庫和文獻檢索化合物、作用靶點以及疾病的靶點信息，通過構建網絡通路可視化展示“藥物-靶點-疾病”的方法，同時對網絡中特性靶點在細胞、分子以及生物整體水平上的通路分析，從而預測藥物治療疾病的有效成分、相關靶點及作用機制等［8］。故通過網絡藥理學的方法，來探討黃連生物堿治療心力衰竭的有效成分、相關靶點及作用機制。

心力衰竭是心血管疾病的嚴重表現或晚期階段，致殘率及致死率居高不下，其常見病因分類有心肌病變、免疫及炎癥介導的心肌損害、心臟負荷異常及心律失常等。目前認為影響心衰的關鍵因素是神經內分泌疾病導致心肌重構，進而出現心衰。目前對心衰的預防包括［1］：對危險因素的干預，包括長期有效的控制血壓、血脂、血糖，篩查高危人群；干預無癥狀性左心室收縮功能障礙。西藥臨床治療心衰主要通過利尿、強心、擴張冠狀動脈等治療方式，達到拮抗心肌重構的目的。

黃連作為常用的中藥，首載于《神農本草經》，其味苦，性寒，歸心、脾、胃等經，《日華子本草》記載：“治五勞七傷，益氣，止心腹痛。驚悸煩躁，潤心肺，長肉，止血……”現代研究表明，其含有生物堿、木脂素、香豆素、黃酮、萜類等多種化合物，具有抗氧化、抗炎、降糖、抗菌等作用［9］。

本研究通過對黃連生物堿的相關靶點進行篩選，共有20 個靶點蛋白，通過對預測靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及拓撲學參數分析，可知靶蛋白具有一定協同性，在GO 通路富集分析可知，預測靶點蛋白的作用于循環及神經體液因素相關。在KEGG 分析過程中，結果預測其主要與神經體液、離子信號通路等相關調節。其神經活性配體-受體作用通路包括了α2腎上腺素能受體、M2膽堿受體（muscarinic acetylcholine receptor m2，CHRM2）等。在心力衰竭的神經體液機制中，隨著心臟射血量不足，交感神經系統活性增高，體內的去甲腎上腺素水平升高，作用于β1腎上腺素能受體，通過cAMP-PKA通路，使細胞內cAMP升高，激活鈣離子通道，使細胞內Ca2+濃度升高，從而增加心肌收縮，提高心排血量。且增加心臟后負荷，心肌耗氧量上升，同時會提高心率。同時去甲腎上腺素的水平升高，可直接導致心肌細胞凋亡、壞死，最終使心室重構，導致心臟衰竭。神經活性配體-受體相互作用通路中，其預測機制可能是激動血管壁的α2腎上腺素能受體，抑制去甲腎上腺素釋放，降低細胞內Ca2+濃度，從而拮抗交感神經興奮性增強，減少心室做功，從而達到拮抗心室重構的作用［10］。相關臨床研究發現，α2腎上腺素受體激動藥物可樂定可用于治療急性或慢性心力衰竭［11］。M 膽堿受體具有膽堿能神經傳遞作用，其中M2 型主要分布于心臟和突觸前末梢，其作用機制為通過與G 蛋白偶聯，激活受體激活磷脂酶C，促進IP3 與DAG 生成，抑制腺苷酸環化酶活性，調節K+/Ca2+離子通道，從而調節心肌收縮。在心力衰竭的過程中，血漿中去甲腎上腺素水平升高，短期內可進行代償血流動力學異常，長期保持濃度增加可導致心肌缺血，從而發生心律失常。相關臨床研究發現，M2受體具有調節心率的作用［12-13］。根據蛋白互助網絡可知，CHRM2與ADRA2具有協同作用，可以預測，黃連生物堿可激動M 受體，起到減慢心率，減緩心肌收縮力，減少心肌耗氧量，緩解心肌缺血，起到保護心肌細胞的作用。

鈣離子通道廣泛存在于機體細胞中，起到調節細胞內鈣離子濃度的作用，從而起到產生、傳遞興奮、介導興奮-收縮偶聯等作用。它有多種亞型，在心臟部位主要為L 型，在KEGG 結果中，它又包括了NOS2 及CHRM2 等。NOS2 可通過PKG 磷酸化抑 制Ca2+內 流，降 低β 腎 上 腺 素 受 體 表 達［14］。CHRM2可通過與G偶聯，調節Ca2+離子通道，從而調節心肌收縮。心力衰竭時交感神經興奮性增強，心臟β 腎上腺素受體激活，使心肌細胞鈣離子通道開放，代償心臟負荷變化，長期導致心臟重構，可預測其作用機制為通過調控鈣離子通道，拮抗心肌過度收縮，拮抗心室重構。

心臟重構是導致心力衰竭發展的基礎，心臟功能受損，心腔增大、心肌肥厚進行代償；心肌氧耗及能量不足，更加劇了心肌整體收縮力下降，形成惡性循環。HIF-1 信號通路主要表達在缺氧的狀態下發揮作用，HIF-1 由α 和β 兩個亞基組成，缺氧時，脯氨酸羥化酶的羥化作用減弱，HIF-1a的降解減少，同時增強缺氧相關基因的表達。研究發現，心臟特異性pVHL 基因被敲除的小鼠，其心肌纖維化，心肌發生重構，導致其心力衰竭［15］。HOLSCHER 等［16］研究發現，心力衰竭患者心肌的HIF 表達與正常心肌相比，增長了1.5 倍。通過KEGG 及蛋白-蛋白互助網絡結果，可預測機制或為通過抑制HIF-1 表達，降低HIF-1 的濃度，起到保護心肌細胞的作用。

cGMP/cAMP 為細胞內第二信使物質，是第一信使作用后產生的信息分子。其具有調控心肌、血管等功能。當β 腎上腺素受體激活后，cAMP 可激活PKA，通過作用于心肌肌鈣蛋白，降低Ca2+敏感性；同時可加速橫橋循環，使心肌舒張［17］。另一方面，心肌細胞鈣離子通道使其作用靶點，通過增加Ca2+通道開放率，使動作電位時細胞內Ca2+濃度上升，增強心肌收縮力［18］。LV等［19］研究發現，β1-ARcAMP-PKA 通路激活使心臟成纖維細胞的增殖，長期β 腎上腺素受體激活與心臟纖維化密切相關，將誘導心肌細胞凋亡，導致心臟衰竭的發生。cGMP 通路受多種物質影響，包括一氧化氮、鈉尿肽等。心力衰竭時心肌細胞為適應心臟負荷，結構發生改變，導致心肌細胞缺氧、ATP 合成減少，引起一系列病理反應，導致cGMP-PKG 信號通路中斷，心肌重構的發生。根據KEGG 通路分析可知，在cGMP/cAMP 通路的作用機制或為通過神經活性配體-受體相互作用通路，通過神經體液機制，調控β 腎上腺素受體激活，影響cGMP/cAMP 的水平，調整鈣離子內流及PKA、PKG 的濃度，從而抑制心肌細胞凋亡。

本研究通過網絡藥理學發掘黃連生物堿治療心力衰竭的靶點，探討了黃連生物堿治療心力衰竭的機制，為心力衰竭的治療發展開辟了新的思路，對未來的相關實驗研究提供了新的方向。本次研究仍有不足之處，未能對網絡藥理學挖掘的黃連生物堿治療心力衰竭的靶點進行實驗認證。