常規抗結核化療對腸道菌群的影響

張晨晨 余美玲 譚衛國 巫株華 魏文靜

1廣東省結核病控制中心（廣州 510630）；2深圳市慢性病防治中心（廣東 深圳 518020）

結核病不僅威脅人類健康還給全球經濟造成巨大負擔，2020年全球新發結核病患者987 萬，發病率127/10 萬，病死率15%［1］。針對藥物敏感型結核病患者，世界衛生組織（WHO）推廣使用標準短程化療方案：利福平（RIF，R）、異煙肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）和吡嗪酰胺（PZA，Z）聯合使用2 個月，然后繼續服用RIF 和INH 至少4 個月［2］。腸道菌群參與機體物質代謝和免疫應答反應，成為目前研究的熱點之一［3-6］，且對維持呼吸系統穩態，尤其是肺部的穩態發揮著重要作用［7-8］，多種抗生素長期聯合使用，可能會改變結核患者腸道菌群的多樣性和結構，進而影響治療結果。

與16s rDNA 高通量測序相比，宏基因組測序技術不僅檢測速度快、靈敏度高，還可對樣本中菌群多樣性、種群結構、進化關系、功能活性以及相互關系等進行綜合全面分析［9］，本研究比較了健康人群、潛伏性結核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）者、HRZE 四聯抗生素抗結核化療期間不同時間點結核患者腸道微生物群的變化，初步探索了結核分枝桿菌（Mtb）感染以及抗結核藥物強化治療對腸道菌群的影響，為抗結核藥物合理使用及改善腸道菌群提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象該研究為病例對照研究，依據《潛伏性結核感染管理指南》和《WS288-2017 肺結核診斷》，經臨床、實驗室及影像學檢查方法篩選LTBI和結核病患者。選取2016年11月至2017年12月在深圳市慢性病防治中心進行體檢的15 名健康者為Un組，其中女7例（46.67%），平均（34.80±10.35）歲。另選同一研究周期該中心確診的γ 干擾素釋放試驗為陽性的16 例LTBI 者為LT 組，其中女5 例（31.25%），平均（38.00 ± 10.64）歲。17 例初診肺結核且未進行治療的患者為T0 組，其中女4 例（23.53%），平均（35.76±12.61）歲。T0 組經一線抗結核藥物聯合治療2 個月后記為T2 組（17 例）；T0 組經6 個月治療且治愈后記為T6 組（17 例）；T0組經6 個月治愈并完成2 個月隨訪者記為T8 組（7 例），其中因人口流動等原因有10 例未完成隨訪。各研究隊列的性別和年齡比例差異均無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：常住深圳人口，生活作息正常；不抽煙酗酒；無其他如心、肝、肺、腎功能障礙等重大疾病；無HIV 感染、急性惡性腫瘤和糖尿病史等；納入研究隊列前至少2 個月禁用微生態制劑和抗生素［10］。深圳市慢性病防治中心醫學倫理委員會已審核通過本研究方案，且所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 糞便樣品采集及微生物DNA 提取用無菌采集管留取各研究對象的新鮮糞便樣本（樣本量＞1 g），低溫條件下迅速轉至實驗室的-80 ℃超低溫冰箱，可長期保存備用。樣品DNA 提取可采用糞便DNA 微型試劑盒（MP Biomedicals）。

1.3 宏基因組測序及信息分析流程將合格的DNA 樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行宏基因組測序，信息分析流程如下：（1）測序結果預處理：使用Readfq（V8）對Illumina HiSeq 測序平臺的原始數據進行預處理，獲得后續分析的有效數據，如果樣品存在宿主污染，則采用Bowite2 軟件（version2.2.4）過濾掉可能來源于宿主的reads。（2）Metagenome 組裝：使用SOAP denovo軟件（V2.04）對有效數據組裝分析。（3）基因預測及豐度分析：采用MetaGeneMark 軟件進行ORF（Open Reading Frame）預測及過濾，并用CD-HIT（V4.5.8）軟件去冗余，再用Bowite2 軟件獲得后續分析的gene catalogue（Unigenes）。（4）物種注釋：使用DIAMOND 軟件（v0.9.9.110）將Unigenes 從NCBI 的NR 數據庫（Version：2018-01-02）中抽提出的細菌、真菌、古生菌和病毒序列進行比對，運用LCA 算法進行物種注釋。（5）常用功能數據庫注釋：將Unigenes 與功能數據庫KEGG 數據庫（Version 2018-01-01）、egg-NOG 數據庫（Version 4.5）、CAZy 數據庫（Version 201801）比對，選取豐度排名前34 的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從功能差異層面進行聚類。

1.4 統計學方法使用GraphPad Prism 7 軟件繪圖，SPSS 17.0 軟件分析數據，Kruskal-Wallis 檢驗用于比較分析各研究隊列非冗余基因數（number of non-redundant genes）和多樣性差異，當P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序結果概述本研究所得原始數據共計741 864.38 Mbp，平均數據量8 335.55 Mbp，質控所得有效數據736 782.68 Mbp（有效率99.32%），平均數據量8 278.46 Mbp。樣品經單獨及混合組裝，所得Scaftigs 共計10 561 556 134 bp，平均長度2 218 bp。進一步的，基因預測由MetaGeneMark 軟件完成，共得到12 877 969 個ORFs，平均每個樣品143 089 個ORFs；經去冗余后，共獲得2 629 714個ORFs，總長1 937.35 Mbp，平均長度736.72 bp，GC含量47.04%，其中完整基因個數為421 096，占所有非冗余基因總數的16.01%。使用blastp 將非冗余基因集比對到MicroNR 庫，注釋到屬和門的比例分別為63.83%，87.22%。非冗余基因集的常用功能數據庫注釋可由DIAMOND 軟件分析完成（e-value 不大于10-5），比對到KEGG 數據庫、eggNOG 數據庫和CAZy 數據庫的ORFs 分別為1 752 149（66.63%）、1 714 019（65.18%）和84 677（3.22%）。

2.2 Mtb 感染對腸道菌群的影響

2.2.1 Mtb 感染后腸道菌群菌群多樣性變化從基因在各樣品中的豐度表出發，隨機從Un、LT 和T0 各研究隊列中分別抽取不同數目的樣品，將得到的不同樣品組合間的基因數目用于繪制Pan 基因稀釋曲線，見圖1A。與Un 組和LT 組相比，T0組腸道菌群中的非冗余基因數未發生顯著變化（均P＞0.05，圖1B）。利用Alpha 多樣性分析法對不同組別間菌群豐富度進行分析，計算Shannon 指數，統計分析發現Un、LT 和T0 三組研究對象腸道菌群豐富度指數差異無統計學意義（均P＞0.05，圖1C），說明Mtb 感染未引起人腸道菌群豐富度的改變。Beta 多樣性反應了各樣本間菌群的整體差異程度，兩樣本之間的距離越大表示兩者間的群落構成差異程度越大，基于Bray-Curtis 距離指標，本研究使用主坐標分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA）進一步分析了Mtb 感染對各組腸道菌群結構多樣性的影響，T0 組與Un 組在PC2 上存在顯著的菌群結構差異（P=0.013 4，圖1D）。

圖1 Mtb 感染后腸道菌群多樣性變化Fig.1 Changes of gut microbiota diversity after Mtb infection

2.2.2 Mtb 感染后腸道菌群結構組成本研究統計了Un、LT 和T0 組在屬水平上各微生物的相對豐度（圖1E），結果顯示，三組中物種豐度較高的屬有10 種，T0 組中梭菌屬（g__Clostridium）的相對豐度為4.28%，較Un組（8.09%）和LT組（6.80%）減少；LT 組和T0 組中巨單胞菌屬（g__Megamonas）的相對豐度分別為0.26%和0.16%，比Un 組（2.58%）明顯減少；LT 組中優桿菌屬（g__Eubacterium）、普雷沃菌屬（g__Prevotella）和小類桿菌屬（g__Dialister）的相對豐度分別為6.27%、3.01%和2.60%，比Un組（3.98%、0.57%和0.09%）和T0 組（2.74%、0.39%和0.07%）增加；T0 組中韋永氏球菌屬（g__Veillonella）和擬桿菌屬（g__Bacteroides）的相對豐度分別為1.54%和8.28%，較Un 組（0.32%、3.32%）和LT 組（0.21%、3.07%）明顯增加。

2.3 常規抗結核化療對結核病患者腸道菌群影響

2.3.1 常規抗結核化療對結核病患者腸道菌群多樣性影響隨機從T0、T2、T6 和T8 各研究隊列中分別抽取不同數目的樣品，將得到不同樣品組合間的基因數目用于繪制Pan 基因稀釋曲線，如圖2A 所示。分別與T2 組、T6 組和T8 組進行比較，T0 組患者腸道菌群中的非冗余基因數差異有統計學意義（均P＜0.05，圖2B）。Alpha 多樣性分析發現，T0 組、T2 組和T6 組間的Shannon 指數差異存在統計學意義（P=0.008 8，圖2C），說明結核病患者經常規抗結核化療后，腸道內微生物的豐富度明顯降低。基于Bray-Curtis 距離指標，使用主坐標分析法（PCoA）分析常規抗結核化療對結核病患者腸道菌群結構多樣性的影響，見圖2D，T0 組與T6 組在PC1 上存在顯著的菌群結構差異（P=0.002 1）。

2.3.2 常規抗結核化療對結核病患者腸道菌群結構組成影響統計T0、T2、T6 和T8 組在屬水平上各微生物的相對豐度（圖2E），結果顯示，三組中物種豐度較高的屬有10 種，相對豐度最高的為擬桿菌屬（g__Bacteroides）；隨著常規抗結核化療時間延長，韋永氏球菌屬（g__Veillonella）、小類桿菌屬（g__Dialister）和普雷沃菌屬（g__Prevotella）在T0組（1.54%，0.07%，0.39%）、T2 組（3.88%，2.46%，1.37%）、T6（6.89%，2.91%，1.72%）組和T8組（7.79%，3.24%，2.65%）中的相對豐度逐漸增加；梭菌屬（g__Clostridium）和糞桿菌屬（g__Faecalibacterium）在T0 組（4.28%，6.10%）、T2 組（3.07%，8.47%）、T6組（3.00%，4.25%）和T8 組（2.21%，1.41%）中的相對豐度逐漸減少。

圖2 常規抗結核化療對結核病患者腸道菌群多樣性影響Fig.2 Effects of conventional anti-tuberculosis chemotherapy on gut microbiota diversity of tuberculosis patients

2.4 差異菌群分析在屬水平上，選取Un、LT、T0、T2、T6 和T8 組樣本中相對豐度排名前35 位的物種進行分析，用熱圖進行可視化展示尋找變化差異較大的菌種，并從物種層面進行聚類，從而找出各組中聚類較多的物種（圖3）。T0 組中的Erysipelatoclostridium和解黃酮菌屬（Flavonifractor）與Un 組相比，顯著增加；而梭菌屬（Clostridium）和嗜血桿菌屬（Haemophilus）較Un 組則顯著減少。T8組中支原體屬（Mycoplasma）、優桿菌屬（Eubacterium）、Dorea、扣林氏菌屬（Collinsella）、顫桿菌屬（Oscillibacter）、芽殖菌屬（Gemmiger）和糞桿菌屬（Faecalibacterium）較T0 組中顯著減少。為進一步發現高維度生物標識，通過線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）展示了各組在不同分類水平上有顯著性差異的物種（圖4），柱狀圖的長度（即LDA SCORE，默認設置為4.0）代表了差異物種的影響大小。

圖3 屬水平上差異物種的熱圖Fig.3 Heat map of different species at the genus level

圖4 LDA 值分布柱狀圖Fig.4 Bar chart of LDA score distribution

2.5 基于物種豐度的降維分析用無度量多維標定法（NMDS，Non-Metric Multi-Dimensional Scaling）分析Un、LT、T0、T2、T6 和T8 組樣本的組內或組間差異，圖中各點之間的相互距離表示不同樣本間的差異大小。見圖5，Stress=0.132，表明NMDS 分析是可信的，在MDS1 上，各組間比較差異無統計學意義，表明各組樣本的物種組成無明顯變化；而MDS2 上，T6 組與Un、LT、T0 和T2 組相比，菌落組成差異較大（均P＜0.05）。

圖5 屬水平上的NMDS 圖Fig.5 NMDS diagram at the genus level

2.6 基因功能注釋分析見圖6，與T0 組相比，結核病患者經常規抗結核化療后，腸道內微生物群中部分功能途徑發生變化，其中最顯著的變化是抗結核治療過程中輔助因子和維生素代謝（Cofactor and vitamin metabolism）、脂多糖代謝（Lipopolysaccharide metabolism）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、原核生物的碳固定途徑（Carbon fixation pathways in prokaryotes）和檸檬酸循環（citrate cycle）功能顯著升高。

圖6 功能豐度聚類熱圖Fig.6 Clustering heat map of functional abundance

3 討論

腸道菌群失調可導致炎癥反應，通過腸-肺軸降低肺部對外來病原體的清除能力，所以腸道菌群的穩態對肺部健康起著重要作用［11］。為有效預防和治療結核病提供理論基礎，本研究選取了結核分枝桿菌感染及抗結核化療不同階段的患者樣本，通過宏基因組測序分析發現，結核病患者與健康人群、LTBI 者相比，腸道菌群中非冗余基因數和Alpha 多樣性均無明顯變化，而菌群結構組成則存在較大差異。結核病患者腸道中梭菌屬的相對豐度降低，而韋永氏球菌屬和擬桿菌屬的相對豐度則明顯增加。近年來，有大量研究［12-14］結果顯示，結核分枝桿菌侵入機體后導致其腸道菌群結構發生改變。OSEI 等［15］的研究顯示，結核分枝桿菌侵染小鼠導致其腸道內厚壁菌門和梭菌目的數量明顯減低；相類似的，結核分枝桿菌侵入人類和恒河猴后，未明顯改變其腸道中微生物數量、豐富度和多樣性，但卻導致其腸道中脆弱類桿菌（Bacteroides frafilis）等類桿菌的數量明顯增加，而厚壁菌門和梭菌目的數量明顯降低［16］，這與本文的研究結果相一致。

與初診結核病且未進行治療的肺結核患者相比，常規抗結核化療后結核病患者腸道菌群中的非冗余基因數、Alpha 多樣性和菌群結構都出現顯著性差異。近年來，細菌16S rDNA 測序和宏基因組測序技術普遍應用于人體腸道菌群結構及功能改變的研究中，并獲得了大量的數據［17］。HU 等［16］發現，結核分枝桿菌侵入機體會略微降低其腸道微生物多樣性，并未對腸道菌群結構產生顯著變化，但經常規抗結核化療后其菌群多樣性和結構發生明顯改變，其中擬桿菌屬相對豐度升高，而糞桿菌屬和活潑瘤胃球菌的相對豐度則明顯降低，這與本文的研究結果相似。而WIPPERMAN 等［18］對正在進行常規抗結核化療和已經治愈的結核病患者進行對比研究發現，兩組患者的腸道菌群多樣性改變并不明顯，但在隨訪的1～2年內其菌群結構則存在明顯改變。不同的研究設計，受到地域、生活習慣等復雜外源性因素和遺傳背景影響［19］，所得結論難以統一，但基本可以確定抗結核化療可導致腸道菌群結構發生明顯變化，且可持續至停藥后較長時間。

抗結核藥物雖對結核病治療有明顯療效，但對腸道的物質代謝卻造成了嚴重影響。MAJI 等［20］的研究表明，肺結核患者進行常規抗結核化療后，其腸道微生物中與代謝相關的功能基因出現改變，其中與氨基酸及輔酶合成和維生素代謝相關基因降低，丙酸鹽和丁酸鹽代謝通路基因升高，致病性相關基因升高。另有研究［18］表明，因腸道菌群結構改變導致其物質代謝也發生相應改變，如膽汁酸合成量降低，而脂肪酸氧化及維生素合成升高等。不同的研究［21］中，腸道菌群功能變化有差異，這可能與樣本量的多少、腸道菌群的復雜程度、測序及分析方法等多種因素有關。本研究通過功能注釋，發現抗結核化療過程中輔助因子和維生素代謝及脂多糖代謝功能顯著升高。

綜上所述，與機體感染結核分枝桿菌相比，抗結核化療造成了腸道菌群多樣性、結構組成和代謝功能等多方面的改變。了解肺結核患者腸道微生物改變對機體免疫調控和開發新的分子標志物都具有推動作用；另外，未來在抗結核化療過程中，重建患者的腸道微生物群有望提高結核病的治療效果。本研究對同一結核病患者的不同抗結核化療階段進行了追蹤隨訪，研究結果有較強的參考價值，但每組納入的研究對象數量相對較少，后續還需擴大各研究隊列的樣本量、優化隨訪方法并延長隨訪時間，進一步深入的探索結核分枝桿菌感染及抗結核化療對腸道菌群的影響。