miR-210-5p修飾間充質干細胞源外泌體促進大鼠脊髓損傷修復的機制

周永新 翟文靜 賈志強 趙曉光 王磊 方麗萍 翟莎菲 黃濤

1西安醫學院第一附屬醫院骨科（西安 710077）；2西安交通大學第二附屬醫院（西安 710004）；3河南科技大學第二附屬醫院（河南 洛陽 471099）；4西安市人民醫院（西安 710068）；5西安醫學院口腔醫學院（西安 710021）

脊髓損傷（SCI）是脊柱損傷最嚴重的并發癥之一，可導致嚴重的肢體功能障礙［1］。然而，在SCI 的治療中仍缺乏有效的治療手段［2］。目前，間充質干細胞（MSCs）移植技術被廣泛用于SCI治療［3-4］。近年來，大量研究提供了強有力的證據，通過將治療性miRNA 轉移到產生外泌體的細胞，可以在培養物中制造外泌體。在已知產生外泌體的細胞類型中，MSCs 是最常見的，因此將含有治療性miRNA 的MSCs 用于治療SCI 可發揮更好的臨床療效［5］。脊髓損傷后會有多個miRNA的異常表達，而miR-210 的過表達可在SCI 大鼠中發揮神經保護作用［6］。miR-210-5p 屬于miR-210基因家族［7］，但關于miR-210-5p 在治療脊髓損傷中的作用尚未明確。因此，本研究通過觀察miR-210-5p 外泌體在SCI 大鼠的功能恢復中的作用及其調節機制，旨在為SCI 治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物成年雄性SD 大鼠（200±25 g）由西安交通大學實驗動物中心提供（許可證號為SCXK（陜）2020-001）。將所有動物在光循環控制環境中飼養1 周，自由進食進水。所有動物護理和實驗程序均經西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，并符合科技部的《實驗動物使用準則》和美國國立衛生研究院批準的《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 主要試劑DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素；細胞轉染試劑Lipofectamine 2000TM；山羊抗兔、兔抗鼠IgG；TRIzol 試劑；ExoQuick exosome提取試劑盒；反轉錄試劑盒，miScript SYBR Green熒光定量PCR 試劑盒；RIPA 裂解緩沖液和BCA 蛋白測定試劑盒；ECL 化學發光試劑盒。

1.3 儀器KZ-Ⅱ型勻漿儀；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機；Multiskan FC 型多功能酶標分析儀；Real-time PCR儀；20486型顯微攝像儀；NikonDSU3 型成像系統。

1.4 方法

1.4.1 MSCs 取材、分離和培養從體質量80～100 g 的雄性大鼠中分離股骨和脛骨的骨髓，PBS沖洗，收集沖洗液4 ℃，以1 000×g離心5 min，將沉淀物用PBS制成濃度為1×1010細胞/L的懸浮液，并將其接種于含15%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基中，然后在5%的CO2培養箱中37 ℃培養。每3 d更換一次培養基，當細胞融合達85%左右時，進行消化和傳代。

1.4.2 實驗動物處理將60只SD大鼠按每組12只隨機分為假手術組、SCI 組、MSCs 組、MSCs-NC mimic 組和miR-210-5p 外泌體組。造模方法：基于LIU 等［8］方法用中度挫傷誘導SD 大鼠SCI 模型。造模成功后，每天尾靜脈注射200 μL 的MSCs 外泌體或NC mimic 外泌體或miR-210-5p 外泌體；假手術組和SCI 模型組每天尾靜脈注射200 μL 的生理鹽水溶液，連續7 d。建模成功2 周后，二氧化碳窒息處死所有SD 大鼠。

1.4.3 運動能力評估通過運用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運動評定量表，從0～21 評估后肢運動功能的恢復：0，無運動活動；21，正常運動［9］。兩名對治療不知情的獨立研究人員在受傷前以及受傷后第5、9、14 天觀察了運動并對運動功能進行了評分。

1.4.4 RT-qPCR 檢測根據制造商的說明，通過TRIzol 試劑提取來自MSCs、外泌體或脊髓組織中的總RNA。對于體內研究，取一段長10 mm 的脊髓，其中包含震中損傷的部位。將總RNA 逆轉錄成cDNA，利用miScript SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒進行實時定量PCR，經2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達。

1.4.5 Western blot利用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 蛋白測定試劑盒評估蛋白質濃度，在12%的SDS-PAGE 上分離并轉移至PVDF 膜。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。與二抗在室溫下孵育1 h。利用ECL 化學發光試劑盒使條帶可視化，并通過化學發光成像系統拍照，Image J 軟件進行量化帶灰度值。

1.5 統計學方法所有結果均為計量資料，以均數±標準差表示。運用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，兩組之間的比較采用t檢驗進行，多組之間比較采用單因素方差分析進行。所有實驗重復至少三次，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進SCI 大鼠的功能恢復SCI 損傷后，BBB 評分約為0.1，提示成功構建SCI 模型。5 d 后，觀察到miR-210-5p外泌體組比NC mimic 對照組大鼠的運動功能評分顯著升高（第5 天，P＜0.05；第9 天，P＜0.001；第14 天，P＜0.01）。見表1。

表1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體對SCI 大鼠BBB 評分的影響Tab.1 Effects of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes on BBB scores in SCI rats ±s

表1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體對SCI 大鼠BBB 評分的影響Tab.1 Effects of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes on BBB scores in SCI rats ±s

注：與假手術組比較，1P＜0.05，2P＜0.01；與模型組比較，4P＜0.05，5P＜0.01；與MSCs 組比較，nsP＞0.05；與MSCs-NC mimic 組比較，3P＜0.01

組別/時間假手術組模型組MSCs組MSCs-NCmimic組miR-210-5p外泌體組建模后14±2.5 0.1±0.02 0.1±0.03 0.1±0.01 0.1±0.02 5 d 20±1.0 1±0.072 3±0.104 4±0.14ns 10±0.183 9 d 20±0.7 2±0.102 5±0.124 6±0.09ns 14±0.353 14 d 20±0.9 2±0.052 7±0.155 8±0.21ns 16±0.433

2.2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進SCI 大鼠Nrf2 的表達與SCI 模型組相比，用miR-210-5p外泌體注射SCI 大鼠，顯著增加了大鼠脊髓組織中GAP-43和NF的蛋白表達（P＜0.01）。SCI后的大鼠脊髓組織中Nrf2 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），注射miR-210-5p外泌體后SCI大鼠的Nrf2蛋白表達水平升高，恢復到正常表達水平（P＞0.05）。見圖1。

圖1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進SCI 大鼠軸突生長和Nrf2 的表達Fig.1 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted axonal outgrowth and Nrf2 expression in SCI rats

2.3 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體通過Keap1-Nrf-2 信號通路促進SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達與假手術組大鼠相比，SCI 組脊髓組織中的Keap1 表達顯著上調，Nrf-2、血紅素加氧酶1（HO-1）、醌氧化還原酶（NQO1）的mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；miR-210-5p 分泌體注射SCI 大鼠后脊髓組織中Keap1 的表達顯著降低，Nrf-2、HO-1、NQO1 的表達顯著增加（P＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體激活SCI 大鼠的Keap1-Nrf-2 信號通路Fig.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 and GCLC in SCI rats

表2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達Tab.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 in SCI rats±s

表2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達Tab.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 in SCI rats±s

注：與假手術組比較，1P＜0.05，2P＜0.01；與模型組比較，4P＜0.05，5P＜0.01；與MSCs 組比較，nsP＜0.05；與MSCs-NC mimic 組比較，3P＜0.01；與miR-210-5p 外泌體組比較，6P＜0.01；與MSCs+ML385 組比較，7P＜0.05

組別/指標假手術組模型組MSCs 組MSCs-NC mimic 組miR-210-5p 外泌體組MSCs+ML385 組miR-210-5p 外泌體+ML385 組HO-1 mRNA 1.0±0.04 0.2±0.022 0.4±0.044 0.41±0.03ns 0.93±0.063 0.35±0.04ns 0.46±0.036,7 NQO1 mRNA 1.0±0.04 0.3±0.022 0.5±0.054 0.48±0.02ns 0.92±0.033 0.4±0.04ns 0.6±0.036,7

3 討論

SCI 的發生會誘導多個miRNAs 的異常表達，引起繼發性損傷反應，包括炎癥、凋亡和氧化應激。越來越多的證據表明miRNAs 在SCI 的發病過程中發揮一定的生物學效應［10-12］。例如，miR-384-5p 在SCI 大鼠中顯著下調，而miR-384-5p 的過表達可以通過抑制自噬和內質網應激促進SCI 大鼠的恢復［13］；miR-21-5p 通過PI3K/AKT 途徑減少神經細胞的凋亡和炎癥，促進SCI 大鼠的恢復［14］。外泌體是一種新型的細胞間通信器，已被用作局部或全身輸送miRNA 的生物載體，用于治療各種疾病，包括脊髓損傷。例如，miR-133 修飾MSCs 外泌體促進神經元存活和軸突再生，改善脊髓損傷后后肢運動功能的恢復［15］；miR-544 修飾MSCs 源的外泌體通過減輕脊髓損傷后的炎癥，改善功能恢復并促進神經元存活［16］；microRNA-124 修飾骨髓MSCs 通過加速MSCs 向神經細胞的分化并促進SCI 修復［17］。以上結果表明外泌體介導的miRNAs轉移是一種新的SCI 治療方法［18-19］。

本研究探討了外泌體介導的miR-210-5p 在SCI 治療中的作用。結果發現，miR-210-5p 外泌體注射顯著增加了SCI 大鼠的BBB 評分（P＜0.01）。這些結果表明，MSCs 通過外泌體傳遞外源性miR-210-5p 以促進大鼠SCI 后的功能恢復。進一步的研究發現miR-210-5p分泌體組大鼠中GAP-43的表達被顯著抑制（P＜0.05），HO-1、NF、NQO1 的表達則被增強（P＜0.05），而Nrf2 的抑制劑ML385 逆轉了miR-210-5p 分泌體在SCI 大鼠中的作用。由此表明，miR-210-5p 外泌體能夠通過激活Keap1-Nrf2信號通路促進SCI大鼠的修復。這與之前關于Keap1/Nrf2 信號通路在SCI 中的報道一致［20］。然而本研究并未在mRNA 水平上進一步探討miR-210-5p 對SCI 大鼠Keap1-Nrf-2 通路影響，后期可進一步深入分析。

綜上所述，miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體能夠通過活化SCI 大鼠的Keap1-Nrf-2 通路來促進大鼠的SCI 修復。