谷子SiSULTR2.1基因的生物信息學(xué)分析及其對 硒、硫的響應(yīng)

石 堯，尹美強，溫銀元，李露露，孫 敏，高志強

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2. 黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 太谷 030801）

谷子［Setaria italica（L.）Beauv］是起源于我國北方的傳統(tǒng)優(yōu)勢農(nóng)作物，具有耐干旱、耐貧瘠、抗逆、適應(yīng)性高等特點。小米是谷子脫殼后的產(chǎn)物，其營養(yǎng)成分與其他禾谷類糧食作物相比相當(dāng)或更優(yōu)［1］。硒于1817年被瑞典化學(xué)家Berzeliu發(fā)現(xiàn)，位于元素周期表第四周期VI主族，化學(xué)性質(zhì)與同一主族的硫和碲相似［2］。其是人和動物體內(nèi)所必需的微量元素，對人體有抗癌、抗氧化防衰老、增強免疫力排毒解毒等作用［3］。人體只有在飲食中攝取有機硒這一條補硒途徑，食源性補硒是改善我國居民健康狀況的必然手段。此外，硒在植物體中也具有非常重要的生理生化作用及功能。

硫轉(zhuǎn)運蛋白是主動轉(zhuǎn)運硫酸鹽時需要的載體蛋白，是植物吸收運輸硫的必需蛋白［4］。硒和硫同屬氧族元素，SeO42-和SO42-競爭細胞膜上的硫轉(zhuǎn)運蛋白［5-6］進入植物體內(nèi)。在模式植物擬南芥中共克隆得到12個硫轉(zhuǎn)運蛋白基因，根據(jù)基因序列相似性，其可以分為4個亞族［7］：SULTR1、SULTR2、SULTR3、SULTR4。SULTR2亞族成員為低親和性硫轉(zhuǎn)運蛋白，負責(zé)將硫酸鹽或硒酸鹽從根皮層轉(zhuǎn)運到木質(zhì)部薄壁細胞，進而運往地上部，是長距離運輸?shù)闹饕D(zhuǎn)運蛋白［8］。所有亞族成員共同完成植物體內(nèi)硫酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運工作。

硫轉(zhuǎn)運蛋白對SeO42-和SO42-選擇性吸收的能力與外界植物種類、轉(zhuǎn)運蛋白類型及硫酸鹽水平等因素有關(guān)［9］。White等［10］研究發(fā)現(xiàn)，高濃度SO42-會在一定程度上抑制植物對SeO42-的吸收。硫酸鹽會抑制擬南芥根系對硒酸鹽的吸收，二者相互競爭硫轉(zhuǎn)運途徑，因而高濃度硒酸鹽會使植物積累大量的硒元素，從而引發(fā)毒性效應(yīng)。Shibagaki等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在硒酸鹽脅迫下，缺乏硫轉(zhuǎn)運蛋白的擬南芥突變體對硒酸鹽有耐受性，表明硒酸鹽能通過硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白進入植物體內(nèi)。Awazuhara等［12］研究發(fā)現(xiàn)，AtSULTR2.1參與控制硫酸鹽的轉(zhuǎn)移，并可能調(diào)節(jié)擬南芥種子的硫狀態(tài)。

植物體內(nèi)硒的含量與植物對硒的吸收和轉(zhuǎn)運能力密切相關(guān)。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）硫轉(zhuǎn)運蛋白第二亞族基因序列為模板，在谷子基因組數(shù)據(jù)庫篩選出與硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因高度相似的同源序列，通過改良RNAiso Plus法［13］提取到谷子幼苗的RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到谷子硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因SiSULTR2.1的cDNA序列。利用生物信息學(xué)方法對基因的序列、系統(tǒng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)進行分析，利用實時熒光定量RCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)研究基因在Na2SeO4、Na2SO4處理后不同時間的表達變化，以求為谷子SiSULTR2.1基因硒、硫轉(zhuǎn)運機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

以在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)申奉試驗地播種的晉谷21號谷子作為試驗材料。取苗期（播種后25 d）完整無病蟲害根、莖、葉部材料和灌漿期（播種后90 d）根、莖、葉、穗部材料，用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赟iSULTR2.1在不同組織中的表達分析。

以晉谷21號為材料，選用10.0 cm×10.0 cm×8.5 cm栽培盆，品氏泥炭土培養(yǎng)，每盆播種12粒完整飽滿的種子，出苗后間苗到每盆9株幼苗。發(fā)芽前均以自來水澆灌，發(fā)芽后在2次Hoagland’s（霍格蘭氏）營養(yǎng)液澆灌之間澆灌2次同體積的自來水。將其培養(yǎng)于寧波東南儀器有限公司的RDN-260E-3D型低溫人工氣候箱中，培養(yǎng)溫度為25℃，濕度為60%/40% RH，光照強度為22000 Lx，光照時間為16 h/8 h。在三葉一心期將其分成三組，一組葉面噴施清水作為對照（130 mL/m2），一組葉面噴施12.5 μmol/L Na2SeO4，一組葉面噴施12.5 μmol/L Na2SO4，后兩組噴施體積與對照組清水體積相同。分別在處理0、12、24、48、96 h后，取完整健康幼苗，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜赟iSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理后表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

采用改良RNAiso Plus法提取到谷子幼苗的RNA，并通過BioDrop超微量紫外分光光度計檢測提取到的RNA的濃度和純度，總RNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑻崛〉玫降墓茸佑酌缈俁NA參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄說明書，利用BIO-GENER基因擴增儀反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 SiSULTR2.1生物信息學(xué)分析

利用蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl）進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用ExPASy-Protparam tool數(shù)據(jù)庫（http://web.expasy.org/protparam/）進行氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、理論等電點等理化性質(zhì)分析；利用ExPASy-ProtScale數(shù)據(jù)庫（https://web.expasy.org/protscale/）進行蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測；利用蛋白質(zhì)信號肽在線預(yù)測工具SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）進行信號肽預(yù)測；利用TMHMM-2.0數(shù)據(jù)庫（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0）預(yù)測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件對谷子硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的氨基酸序列進行多序列比對分析；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用數(shù)據(jù)庫PredictProtein（https://predictprotein.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；利用Cell-PLoc 2.0數(shù)據(jù)庫（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）、WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.3SiSULTR2.1表達模式分析

將1.2.1處反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋5倍，-20℃保存，用于后續(xù)qRT-PCR分析。使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL；上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.4 μL；ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL；cDNA 1.0 μL；加水至總體積10.0 μL；重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，52℃退火30 s，42個循環(huán)；從65℃以每隔5 s上升0.5℃的速度上升至95℃。以Actin為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct法分析結(jié)果。

表1 引物序列Tab. 1 Sequence of primers

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。使用SPSS25軟件進行數(shù)據(jù)處理及多重比較，采用Microsoft Excel 2010軟件制表作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiSULTR2.1的基因鑒定

查閱文獻并在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）搜索下載獲得擬南芥AtSULTR2.1、水稻OsSULTR2.1基因序列。以獲得的擬南芥、水稻硫轉(zhuǎn)運蛋白基因序列為參考，在Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中進行Blast檢索和比對，獲得谷子硫轉(zhuǎn)運蛋白基因序列，并將其命名為SiSULTR2.1。

2.2 SiSULTR2.1蛋白的理化性質(zhì)分析

2.2.1 SiSULTR2.1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示：SiSULTR2.1的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為70374.55 Da，氨基酸數(shù)目為656個；理論等電點為8.81，富含堿性氨基酸；帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）有47個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）有56個；SiSULTR2.1蛋白的分子式為C3195H5112N828O893S30，脂肪指數(shù)為110.61，不穩(wěn)定蛋白指數(shù)為36.88，此類蛋白為穩(wěn)定性蛋白；SiSULTR2.1蛋白中丙氨酸含量最高，占總氨基酸數(shù)的10.8%。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫SMART顯示，SiSULTR2.1蛋白具有硫轉(zhuǎn)運蛋白所特有的Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域（位置：89～471）和STAS結(jié)構(gòu)域（位置：522～641）（圖1）。

圖1 SiSULTR2.1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig. 1 Conservative domains of SiSULTR2.1 protein

2.2.2 SiSULTR2.1蛋白的親疏水性、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用ExPASy-ProtScale數(shù)據(jù)庫對蛋白的親疏水性進行預(yù)測。如圖2所示，SiSULTR2.1蛋白親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域是交叉排列的。Score＞0為疏水區(qū)，Score＜0為親水區(qū)，我們可以看到Score＞0區(qū)域比Score＜0區(qū)域密集。由此可表明，SiSULTR2.1編碼的蛋白是疏水性蛋白。蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果顯示（圖3），SiSULTR2.1無信號肽位點，屬于非分泌蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，SiSULTR2.1有9個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖4），表明SiSULTR2.1蛋白屬于跨膜蛋白。

圖2 SiSULTR2.1蛋白的親疏水性預(yù)測Fig. 2 Prediction of the hydrophobicity of SiSULTR2.1 protein

圖3 SiSULTR2.1蛋白的信號肽預(yù)測Fig. 3 Prediction of SiSULTR2.1 protein signal peptide

圖4 SiSULTR2.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 4 Prediction of the transmembrane domain of SiSULTR2.1 protein

2.3 SiSULTR2.1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN軟件將谷子硫轉(zhuǎn)運蛋白第二亞族基因與水稻、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、擬南芥硫轉(zhuǎn)運蛋白第二亞族基因進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)其序列比對一致性達到71.79%。將谷子硫轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列與水稻、玉米、擬南芥硫轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸序列分別進行雙序列比對，分析發(fā)現(xiàn)其與水稻、玉米同源序列相似性較高，分別為85.45%、88.91%，與擬南芥同源序列相似性不高，為55.99%。

根據(jù)4個物種的10個硫轉(zhuǎn)運蛋白基因氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建進化樹。由圖5可知，谷子與玉米、水稻聚為一大類，其與玉米親緣關(guān)系最近。谷子、玉米、水稻均為禾本科作物，親緣關(guān)系較近；谷子和玉米均為C4作物，而水稻為C3作物，因而谷子玉米親緣關(guān)系最近。

圖5 SiSULTR2.1蛋白與其他植物SULTR2蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of protein between SiSULTR2.1 and SULTR2 of other plantsZm：玉米；Os：水稻；Gm：大豆；At：擬南芥。Zm: Zea mays; Os: Oryza sativa; Gm: Glycine max; At: Arabidopsis thaliana.

2.4 SiSULTR2.1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 SiSULTR2.1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

數(shù)據(jù)庫PredictProtein預(yù)測顯示，谷子硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。SiSULTR2.1蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲占比分別為25.30%、8.54%、66.16%。SiSULTR2.1蛋白含有豐富的α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋可以形成多個跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.4.2 SiSULTR2.1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫在線構(gòu)建SiSULTR2.1的三維結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果顯示，SiSULTR2.1可以較明顯地區(qū)分出STAS結(jié)構(gòu)域和Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域（圖6a）。其中STAS結(jié)構(gòu)域（圖6b）位于羧基末端（C端），含有核苷三磷酸（nucleotide triphosphate，NTP）結(jié)合位點［9］，通過磷酸化和去磷酸化過程［19］調(diào)控SeO42-的轉(zhuǎn)運活力；Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域（圖6c）位于氨基末端（N端），與α-螺旋相互纏繞形成了一個通道結(jié)構(gòu)，有利于硒酸鹽的跨膜轉(zhuǎn)運。

圖6 SiSULTR2.1蛋白的三級結(jié)構(gòu)及STAT結(jié)構(gòu)域、Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 6 Prediction of tertiary structure of SiSULTR2.1 protein, STAS domain and Sulfate-transp domain （a）SiSULTR2.1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；（b）STAS結(jié)構(gòu)域；（c）Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域。(a) Prediction of tertiary structure of SiSULTR2.1 protein; (b) STAS domain; (c) Sulfate-transp domain.

2.4.3 SiSULTR2.1蛋白的亞細胞定位預(yù)測

利用Cell-PLoc和WoLF PSORT數(shù)據(jù)庫對SiSULTR2.1進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果略有不同。Cell-PLoc預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位于線粒體、葉綠體的可能性不大，定位于細胞膜上的可能性較大。WoLF PSORT預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位于液泡膜上。上述結(jié)果表明，SiSULTR2.1可能以一種膜結(jié)合蛋白形式參與SeO42-在細胞的跨膜轉(zhuǎn)運。

2.5 SiSULTR2.1的表達模式分析

2.5.1SiSULTR2.1的組織表達特異性分析

谷子苗期根、莖、葉（圖7a）和灌漿期根、莖、葉、穗（圖7b）的qRT-PCR結(jié)果顯示，SiSULTR2.1在谷子不同部位均有表達，且在不同時期表達量有差異，表現(xiàn)出時空特異性。SiSULTR2.1在苗期莖中的表達量最高，在灌漿期莖、葉片中的表達量均較高。SiSULTR2.1在不同時期根中的表達量均最低，在灌漿期穗中的表達量也較低。

圖7 SiSULTR2.1在谷子不同時期不同組織中的表達Fig. 7 Expression of SiSULTR2.1 in different tissues of millet in different periods（a）SiSULTR2.1在谷子苗期不同組織中的表達；（b）SiSULTR2.1在谷子灌漿期不同組織中的表達。差異顯著性分析采用LSD法。*P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。(a) Expression of SiSULTR2.1 in various tissues of millet at seedling stage; (b) Expression of SiSULTR2.1 in various tissues of millet at filling stag. LSD method was used to analyze the difference significance. *P＜0.01; ***P＜0.001; ****P＜0.0001.

2.5.2SiSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理后的表達分析

由圖8可知，SiSULTR 2.1對Na2SeO4、Na2SO4處理均有表達響應(yīng)，但其對Na2SeO4和Na2SO4處理表達響應(yīng)的模式不一致。Na2SeO4處理12 h時，谷子幼苗SiSULTR 2.1的相對表達量與對照組相近，但處理24、48、96 h時幼苗中的相對表達量均顯著高于對照組，且96 h時表達量達到峰值，是對照組的6.75倍。Na2SO4處理12 h時，谷子幼苗SiSULTR 2.1的相對表達量達到峰值，是對照組的17.75倍，處理24、48 h時幼苗中的相對表達量均顯著高于對照組，但與12 h相比表達量呈下降趨勢，且96 h表達量低于對照組。

圖8 SiSULTR2.1在Na2SeO4、Na2SO4處理下的表達分析Fig. 8 Expression analysis of SiSULTR2.1 under various Na2SeO4 and Na2SO4 treatment conditions（a）SiSULTR2.1在Na2SeO4處理下的表達；（b）SiSULTR2.1在Na2SO4處理下的表達。差異顯著性分析采用LSD法。***P＜0.001；****P＜0.0001。(a) Expression of SiSULTR2.1 in Na2SeO4 treatment conditions; (b) Expression of SiSULTR2.1 in Na2SO4 treatment conditions. LSD method was used to analyze the difference significance. ***P＜0.001; ****P＜0.0001.

3 討論

SiSULTR2.1編碼的谷子硫轉(zhuǎn)運蛋白含有硫轉(zhuǎn)運蛋白所特有的STAS結(jié)構(gòu)域和Sulfate-transp結(jié)構(gòu)域［14］，與前人在茶樹（Camellia sinensis）［9］、馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）［15］、短柄草［Brachypodiumdistachyon（L.）Beauv.］［16］上的研究結(jié)果一致。該基因編碼的蛋白質(zhì)含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。根據(jù)序列同源性，可將SiSULTR2.1歸屬于硫轉(zhuǎn)運蛋白基因家族第二亞族基因，主要負責(zé)硒、硫的遷移轉(zhuǎn)運［17］。SiSULTR2.1是疏水性蛋白，無信號肽序列，屬非分泌蛋白，這些特征與玉米、水稻、薄殼山核桃［Carya illinoinensis（Wangenh.）K. Koch］［18］的硫轉(zhuǎn)運蛋白具有高度的相似性。

組織特異性表達結(jié)果揭示，SiSULTR2.1在谷子根、莖、葉、穗中均有表達，且表達模式與張晶晶等［9］在茶樹上的研究結(jié)果相近，具有明顯的組織特異性。SiSULTR2.1在谷子莖、葉片中的表達量較高，但在根、穗中表達量很低。SiSULTR2.1在根中表達量很低，張晶晶［19］的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。SiSULTR2.1在穗中較低的表達量與前人研究結(jié)果有差異，可能與品種的特異性有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SiSULTR2.1對硒、硫處理有不同的響應(yīng)模式。Na2SeO4處理結(jié)果顯示，處理后12 h內(nèi)SiSULTR2.1表達變化量不大，24 h后表達量顯著增加，且在處理后96 h達到最高。SiSULTR2.1在Na2SeO4處理下隨著處理時間的延長，相對表達量總體呈上升趨勢，倪鐘濤等［18］和胡玉榮等［20］也有類似發(fā)現(xiàn)。Na2SO4處理結(jié)果顯示，處理后12 hSi-SULTR2.1的表達就能被顯著誘導(dǎo)，處理后24、48 h 其表達量有所下降，處理后96 h表達量恢復(fù)到原來的水平。這可能是因為硫是谷子生長發(fā)育所必須的大量元素，谷子幼苗噴施Na2SO4后，硫轉(zhuǎn)運蛋白基因受SO42-誘導(dǎo)短時間內(nèi)大量表達用以轉(zhuǎn)運硫元素。由此可見，SiSULTR2.1能在短時間內(nèi)迅速響應(yīng)Na2SO4的誘導(dǎo)，而響應(yīng)Na2SeO4誘導(dǎo)需要較長時間。Kataoka等［21］研究發(fā)現(xiàn)，SULTR2;1與SULTR3;5均表達于根系維管組織中，主要負責(zé)硫酸鹽向地上部運輸，但是二者是否同樣負責(zé)硒酸鹽從根部向地上部的運輸還未可知。

谷子硫轉(zhuǎn)運蛋白基因家族成員眾多，它們均可能在吸收轉(zhuǎn)運Na2SeO4或Na2SO4的某環(huán)節(jié)中有特定的作用［22］。本研究初步探討了谷子SiSULTR2.1對硒、硫的響應(yīng)，但該基因在硒、硫的吸收、轉(zhuǎn)運方面具體的功能仍需進一步研究探討。