根結線蟲對文冠果苗木根系結構與生長及礦質養分分布特性的影響

王亞晶，郝莎莎,2，衛旭芳，李 洋，張綏林，蘇淑釵，侯智霞*

(1 北京林業大學 林學院省部共建森林培育與保護重點實驗室，北京 100083；2 太原市國土綠化中心，太原 030012)

文冠果(XanthocerassorbifoliaBunge.)又名木瓜，為無患子科文冠果屬落葉喬木或灌木，是中國北方很有發展前途的木本油料植物[1]。文冠果花、葉可制作茶葉，具有降血壓的功效；種仁含油率高達55%～67%，且其中的不飽和脂肪酸比例高[2-3]，是一種高檔木本食用油[4-5]，同時，文冠果油也可生產生物柴油、汽油等，以其加工制成的生物柴油被認為是中國 21 世紀最具潛力的可再生綠色能源，可作為高級潤滑油、增塑劑、化妝品、食品添加劑等工業原料[6]。另外，文冠果果殼、果柄的提取物可以增強記憶力，預防和治療老年癡呆癥，還可以調節血脂、血壓，軟化血管，預防心腦血管等疾病[7]。

植物寄生線蟲是危害農業生產的重要因素之一[8]。全世界每年由線蟲危害而造成的農業損失高達上千億美元[9]。根結線蟲(Meloidogyneincognita)寄主范圍很廣，超過3 000種植物，分屬于114科，遍及糧食、油料、煙草、果樹、蔬菜、花卉等，而在文冠果中根結線蟲相關研究尚不多見。明確根結線蟲對文冠果苗木養分分布特性的影響，能夠為了解根結線蟲對文冠果苗木養分吸收、利用、運轉及生長發育特性的影響提供重要的理論依據，增強文冠果苗木生產中對于線蟲危害的預防和管理，減少損失。

根結線蟲的侵害目標是寄主植物當年生新根，并在根尖建立取食位點，一方面根系受害后吸收礦質元素的能力減弱，影響到各器官的生長發育進程[10]；另一方面根結形成后成為根系上新的養分庫，與其他器官間存在營養競爭關系，根結線蟲侵染植物時分泌酶以及其他活性物質等促使巨細胞的形成與發育，巨細胞為根結線蟲提供養分，有利于線蟲的發育。使這種競爭偏向于根結，保證其生長繁殖對營養元素的需求，同樣影響植物各器官的生長發育，但一般根系受到的影響最明顯。根結破壞植物根部的維管組織，電解質滲透率增大，根系活力下降，使根系吸收能力受到了一定的影響并阻礙水分和養分在植物體內的正常運輸，影響植物的正常代謝，進而影響了植物的生長發育[11]。根結線蟲的侵染會刺激寄主根系形成巨細胞，根系重量明顯增加，這也是根結線蟲引起植株生長指標變化的最典型特征[12]，根結線蟲一方面通過分泌信號物質干擾根系正常的代謝活動，打破原有代謝平衡；另一方面改變根系內基因表達進程，從根本上為其建立穩固的寄生關系服務[13]。

植物根系是礦質元素吸收和運輸的主要器官，對于植物的生長發育有重要的作用。在前期研究過程中，作者發現文冠果苗木根系有不同程度根結線蟲侵染現象。當前關于文冠果研究主要集中在鹽脅迫、抗旱、抗澇、需水、需肥等方面[14-16]，根結線蟲對文冠果苗木生長發育和生理代謝的影響尚不清楚。本研究針對受不同程度根結線蟲侵染的文冠果1年生苗木，分析了苗木的生長發育以及主要礦質養分在苗木中的分布特性，并明確了不同礦質元素與線蟲侵染的關聯關系，旨在為進一步明確根結線蟲對文冠果苗木生長發育特性的影響提供重要的理論基礎，以利于文冠果苗木生產中對線蟲危害的預防和管理。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

研究區位于山東省濰坊市，地處北溫帶季風區，四季分明，年均溫可達12.3 ℃，年均降水量在650 mm左右。土壤養分中全氮含量約1.3～2.1 mg/g,全磷含量約4.07～4.43 mg/g，全鉀含量約15.7～20.46 mg/g，鈉含量0.8～0.9 mg/g、鎂含量4.02～4.70 mg/g、鈣含量17.7～20.07 mg/g。

1.2 研究材料

于2019年10月采集山東省濰坊市文冠果基地不同程度線蟲侵染的文冠果一年生實生苗，并根據病害嚴重度分級標準[8]進行分級(按照根結發生情況分級)。其中， 0 級，根系上無根結; 1 級，輕度感染，僅有少量的小根結，根結率在3.0%及以下；2級，根結率為3.1%～25%; 3級，根結較多，根結率為25.1%～50%；4級，在根結上有再次根結，50.1%～75%根系有根結；5級，根結相互連接成根結團塊，75%以上根系有根結。最終，將本研究中的文冠果植株分為0級(對照組，根系上無根結)、2級(根結率為3.1%～25%)、3級(根結較多，根結率為25.1%～50%)、4級(在根結上有再次根結，根結率為50.1%～75%)4個級別(圖1)。采集不同線蟲侵染程度的文冠果苗木為試驗材料。

圖1 文冠果苗木根結發生狀況等級Fig.1 Occurrence grade of root knot of Xanthoceras sorbifolia seedlings

1.3 研究方法

隨機選取不同線蟲侵害程度的文冠果苗木，0～4級每個級別選取15株，重復3次，共取苗木180株，分為12組樣本。將每個重復(每組樣本)的15株苗木分別分為根、莖、葉三部分。選取部分根系樣品經FAA固定(具有根結的根中選取根結中直徑最大處，無根結根部選取其直徑與根結相近的部位進行取樣和觀察)，制作石蠟切片[17]，用于根部解剖結構觀察；將根部剩余樣品與莖、葉樣品置于105 ℃烘箱中殺青30 min，然后80 ℃下烘干至恒重，將樣品粉碎后用于礦質元素的測定。

精確稱取烘干樣品0.2 g，經濃H2SO4-H2O2消煮后，用連續流動分析儀測定氮、磷元素含量；再精確稱取樣品0.2 g，經HNO3-HClO4消煮后，用原子吸收光譜儀分別測定鉀、鈣、鈉、鎂、鐵、錳、鋅、銅元素含量[18]。

1.4 數據處理

用SPSS 17.0整理分析數據，用Excel 2007作圖, 對文冠果株高、地徑、礦質元素含量等數據進行方差分析(ANOVA)，采用Duncan新復極差測驗法(P<0.05)進行顯著性分析。另外，使用 R語言4.0.5版本軟件進行相關性分析，以探究根結線蟲發生嚴重程度與文冠果幼苗根部、莖部、葉部各礦質元素含量的相關關系。

2 結果與分析

2.1 線蟲侵染對文冠果根系解剖結構的影響

將經固定液固定的線蟲侵染文冠果具根結根段橫切，切面上有白點不斷地出現，位置無規律性(圖2，A)；挑取白點部位組織于解剖鏡下觀察，發現根結線蟲雌蟲體(圖2，B)。文冠果根結線蟲經青島農業大學植物線蟲實驗室鑒定為南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)。

圖2 經石蠟包埋后的具根結的文冠果根及根結線蟲雌蟲體Fig.2 Encapsulated rootknot and M. incognita female body of X. sorbifolia

文冠果苗木正常根系(圖3,A、B)皮層及維管束組織細胞排列整齊；韌皮部細胞排列較緊密，細胞間隙較小；維管形成層由排列緊密的幾層細胞組成，形成層以內是木質部和射線；木質部細胞數量多且分布均勻，與木射線細胞間隔排列，木射線由1～2層細胞組成，呈輻射狀分布；韌皮細胞內含物較少(圖3，B)。具根結的文冠果苗木根系(圖3，C-F)的皮層相對較厚，排列整齊；維管束組織排列不規律，尤其是木質部，多數排列扭曲，導管較少；由薄壁細胞構成的射線數目較少且分布不均勻，靠近皮層一側的韌皮細胞內含物明顯較多。韌皮部可見由于根結線蟲侵害所致的巨細胞(Gc)以及有空泡的巨細胞(圖3，C、E)，可見線蟲痕跡以及巨細胞崩解形成的空腔(圖3，D、F)，多分布于皮層與中柱細胞之間(圖3,C、F)以及韌皮部(圖3，C-F)。

2.2 根結線蟲對文冠果苗木生長的影響

表1顯示，有根結的文冠果2～4級苗木的株高均顯著高于正常植株(P<0.05)，分別比正常苗木的株高增加17%、27%和25%；有根結植株的地徑也不同程度地高于對照，2級和4級根結植株與對照差異不顯著，3級根結植株的地徑顯著高于對照19%。同時，具2～4級根結的文冠果苗木生物量相對于正常植株均發生顯著變化(P<0.05)。其中，它們的地上部分生物量分別比對照顯著增加1.6倍、11%和1.6倍，總生物量分別顯著增加46%、17%和44%；而2級和4級根結苗木的地下部分生物量比對照分別顯著下降25%和29%，3級根結植株的地下部分生物量比對照卻顯著上升21%。可見，線蟲侵染所致根結的存在并沒有減弱一年生文冠果苗木的生長量，反而使其顯著高于未侵染苗木，同時使得地上部和總生物量也顯著增加。

表1 根結線蟲對文冠果株高、地徑、生物量的影響

2.3 根結線蟲對文冠果苗木器官礦質元素分布特性的影響

2.3.1 根部元素含量由表2可知，具2～4級根結的文冠果苗木根部N含量較正常植株分別顯著下降7.8%、16.0%和29.5%(P<0.05)，根部Fe、Zn、Na含量較正常植株顯著增加(P<0.05)，其中Fe含量較正常植株分別增加1.56倍、0.81倍和3倍，Zn含量較正常植株分別增加1.11倍、1.56倍和1.78倍，Na含量較正常植株分別增加1.57倍、0.78倍和3.38倍。具2級和3級根結根部P、Ca含量與正常植株無顯著差異，4級根結根部P含量較正常植株顯著降低(P<0.05)，而其Ca含量則顯著增加。具2級根結的根部K含量較正常植株無顯著差異，而具3級和4級根結根部K含量顯著增加(P<0.05)；具2級和4級根結根部Mg含量較正常植株顯著增加(P<0.05)，其Mn含量則顯著降低(P<0.05)；具2級根結根部Cu含量較正常植株顯著增加(P<0.05)，而3級、4級根結根部Cu含量與正常植株差異不顯著。

表2 根結線蟲對文冠果苗木根部不同元素含量的影響

2.3.2 莖部元素含量由表3可知，具2～4級根結的文冠果苗木莖部N、P、Mg含量較正常植株顯著下降(P<0.05)，其中N含量分別顯著下降30.7%、46.3%和41.7%，P含量分別顯著下降33.0%、51.5%和42.0%，Mg含量分別顯著下降24.1%、27.6%和17.2%；具3級根結苗木莖部Fe含量較正常植株顯著增加66.7%(P<0.05)，2和4級Fe含量與正常植株差異不顯著；具4級根結苗木莖部Cu含量較正常植株顯著下降40%(P<0.05)，具2和3級根結苗木莖部Na含量較正常植株顯著增加(P<0.05)，其Ca、Mn、Zn含量與正常植株均差異不顯著。

表3 根結線蟲對文冠果苗木莖部不同元素含量的影響

2.3.3 葉部元素含量由表4可知，具2～4級根結文冠果苗木葉部N、P、Mg、Mn、Zn、Cu、Na含量均與正常植株差異不顯著；具2級和4級根結苗木葉部K含量較正常植株分別顯著下降61.5%和47.0%，具3級根結苗木葉部K含量與正常植株無顯著差異；具2級根結苗木葉部Ca含量較正常植株顯著增加26.6%，具3和4級根結苗木葉部Ca含量與正常植株無顯著差異；具4級根結苗木葉片Fe含量較正常植株顯著增加，2和3級Fe含量則與正常植株無顯著差異。

表4 根結線蟲對文冠果苗木葉部不同元素含量的影響

2.4 文冠果苗木生物量和線蟲侵染程度與苗木不同器官礦質元素含量的相關性分析

根結線蟲對文冠果苗木根部、莖部、葉部各元素含量的影響程度不盡相同。首先，文冠果苗木根系中N元素含量與根系線蟲侵染率呈顯著負相關(P<0.05)，Zn、K元素所受影響次之，二者含量與侵染率均呈顯著正相關關系(P<0.05)。但總體而言，文冠果苗木根系中各元素含量與植株生物量相關性并不顯著。其次，在受到根結線蟲侵染時，文冠果幼苗葉部的Mg、Zn兩種元素的含量變化與侵染率分別呈顯著負相關和正相關(P<0.05)，即不同程度的侵染使得幼苗葉部這兩種元素含量發生顯著變化。除了葉部的K元素含量與文冠果幼苗受根系線蟲侵染后的整株生物量總體上呈顯著負相關(P<0.05)之外，其他元素含量的變化與苗木生物量變化之間的相關性并未達到顯著水平。再次，根結線蟲對文冠果苗木莖部各元素含量的影響較根系、葉部小，但在莖部各元素中仍是N元素含量所受影響最大，P元素含量所受影響次之，二者在文冠果幼苗莖部的含量與根結線蟲侵染率呈負相關關系(表5)。

表5 文冠果苗木根、莖、葉各元素含量與根結線蟲侵染率、植株生物量相關系數

3 討 論

3.1 根結線蟲侵染文冠果苗木的生長發育特征

根結線蟲與植物的互作機理分為易感寄主與抗性寄主兩種對根結線蟲響應。易感品種對根結線蟲本身無影響，只能被動接受根結線蟲的取食，單方面被線蟲傷害；而抗性寄主在受害的同時也會通過其他途徑影響根結線蟲，抑制其為害，寄主與線蟲可相互作用，根結線蟲最終能否建立寄生關系與蟲體毒力和寄主抗性強弱有關[13]。

本研究發現，具根結的1年生文冠果苗木的株高、地徑較正常苗木發生了顯著變化。其中，2級和3級侵染條件下植株株高、地徑較對照依次增加，這可能與文冠果苗木在受到根結線蟲侵染后，產生了一定的抗性反應，反而導致其生長量增加有關。而在4級程度的侵染條件下，文冠果苗木的株高、地徑較3級侵染增加的少，可能與苗木對于線蟲侵染的嚴重程度有限有關，目前尚未見類似文獻報告。然而，根結線蟲對植物的侵害是一個持續過程，后續文冠果苗木的生長狀況將如何變化，有待于進一步觀察。

3.2 根結線蟲侵染文冠果苗木根系的解剖結構特征

具有侵害性的根結線蟲二齡幼蟲通常由根尖部位侵入寄主植物根系，并向上遷移到中柱維管束附近[19]，建立取食點，誘導寄主細胞發生異常細胞分裂，形成5～7個多核的巨細胞[20]，為根結線蟲的發育提供營養[21]，而根結線蟲固定在巨細胞的細胞壁中間，通過其在巨細胞中構建的取食管吸取營養[22]。巨細胞具有細胞壁增厚，細胞質稠密[23]和多核[24]等特點。巨細胞不斷發育形成根表面肉眼可見的根結或根癭[25]。巨細胞中營養被侵入的根結線蟲耗盡則出現空腔[21]。本研究結果表明根結線蟲對文冠果苗木根系解剖結構的影響主要體現在，改變了根系韌皮部細胞排列緊密程度，使細胞內含物增多；打亂木質部細胞分布結構，使其呈不規則分布，導管變少；多個巨細胞及細胞空腔主要存在于韌皮部細胞。與已報道的線蟲危害的病理癥狀[19-25]類似。本研究中盡管文冠果苗木受到根結線蟲的侵染并形成大量根結，但是生長勢并沒有受到消弱。南方根結線蟲對抗性不同的黃瓜[26]、煙草[27]的侵染研究認為，過敏性壞死、細胞空洞化是抗線蟲侵染共有的防御特征，抗病材料的抗性特征主要表現為抑制巨細胞形成、周圍細胞廣泛空洞化以及提早空洞，巨細胞空洞化出現越早抗性效果越積極[21]。寄主根系一旦出現根結,病理組織結構中不但出現了巨細胞, 還有維管組織的異常分化[28]。本研究中可見多個巨細胞空腔，進一步表明文冠果苗木對于根線蟲的侵染有較強的抗性或者耐受性。另外，根結的形狀與根結線蟲侵染位置和巨細胞來源有關，巨細胞出現在寄主根系中央，根結與根系中心對稱；當巨細胞由維管柱外側韌皮薄壁細胞、中柱鞘及皮層細胞分化而來時，出現在根的維管柱一側, 根結偏于根系中心一側[21，26]。本研究發現文冠果苗木根結存在多種形狀，同時在皮層與維管束細胞之間以及韌皮部中都發現有巨細胞存在，與前述研究一致。

維管系統是植物運輸營養物質的重要通道，根結線蟲對于根系結構尤其是對維管束細胞破壞性的寄生方式會導致寄主植物水分和營養物質運輸的障礙[27]。而本研究中的苗木根系結構盡管出現了根結線蟲侵染的各種危害表型，但對生長發育的消弱并未體現出來，推測這一方面與文冠果苗木本身對根結線蟲的抗性有關，另一方面可能與苗木生長處的環境條件等綜合因素有關。本研究組從具根結的文冠果苗木根系中分離出了具有促生作用的內生細菌[29]，或許與具根結的文冠果苗木生長狀況的差異有一定關系，其間的聯系有待于后續研究揭示。

3.3 根結線蟲侵染文冠果植株各器官礦質元素分布特征

根結線蟲通常為害植物的當年生新根，具根結的吸收根隨著侵害的加劇，逐漸喪失吸收運輸水分和礦質營養的功能，使植物吸收的元素總量減少，必需營養元素在不同器官間重新分配，改變了植物體礦質營養原有的運輸分配規律[30]，影響植物的生長發育；另外，根結線蟲為了滿足發育和繁殖的需求，從其他器官征調需要的營養，與正常組織器官存在營養競爭關系，而且具備競爭優勢。

對線蟲敏感性不同的植物種類或品種被侵染后，植物生理生化響應范圍和強度有明顯的不同[31-32]，這與線蟲毒力和寄主的耐抗性水平有關。本研究中具根結的文冠果植株根、莖、葉部位的氮、磷含量均下降。 N、P 和 K 在被侵染根系中積累與線蟲生長發育關系密切，前人研究也表明根系中 N、P 和 K 積聚對根結線蟲發育有促進作用，這種促進作用與碳水化合物的積累有關[33]。本研究中具根結根系中的N、P含量降低，而K含量在根部顯著增加，葉部較正常植株減少，表明文冠果苗木中的根結線蟲可能對于K的需求更敏感。鉀在根部的積聚可以增加根結內可食性營養物質，從而有利于根結線蟲的發育。

鎂是葉綠素的必需成分，存在于葉綠素分子結構的卟啉環中心，與光合作用直接有關[34]，受根結線蟲侵染的文冠果苗木，葉中鎂含量下降，將對植物的光合作用產生重要的影響；可能低密度的根結刺激了鐵的吸收，而高密度的根結抑制了鐵的吸收。本研究中具2、4級根結苗木莖中的鐵含量低于正常苗木，而3級苗木的鐵含量高于正常苗木，與李文超等[8]的研究結果一致。具4級根結苗木葉中鐵的含量高于正常苗木，說明可能線蟲侵染使苗木發生應激反應促進鐵元素的運輸，而根部鐵含量較對照增加，能促進細胞壁形成和木質化進程[35]。鐵含量的上升，可能使酶活性增加促進巨細胞的生長，為根結線蟲的生長和發育提供有利條件。葉部錳含量較對照降低，錳在光合過程中參與希爾反應，同時光合系統中的反應中心至少需要4個錳原子參與[36]。持續穩定的錳含量是光合作用得以順利進行的條件，低含量的錳可能影響植株光合作用的正常進行。VanGundy等研究得出，線蟲浸染的根系中有較高的鎂、鈉、鉀、銅和鐵[37]，與本研究結果一致，在具根結文冠果根系中有較高的鎂、鈉、鉀、銅和鐵含量。

本研究發現具根結的苗木鋅元素在根系中顯著增加，鋅為吲哚乙酸的前體色氨酸合成所必需，較高含量的鋅能促進 IAA 的合成，而高濃度的 IAA 有利于根結線蟲的侵入和發育[38]；鋅又是多種酶的組成成分和激活劑，缺鋅影響植物的碳水化合物代謝和蛋白質的合成，使光合作用受阻。銅是植物生長所必需的微量元素，是多種蛋白質的輔因子，參與呼吸代謝的氧化還原反應，在葉綠素合成及其保護葉綠素的穩定中起重要的作用。李文超等[8]研究表明接種線蟲的密度越大，銅含量越低。本研究發現具根結苗木的莖和葉片中銅含量低于正常苗木，根系中銅元素有所上升，表明根線蟲侵染會影響苗木對銅元素的吸收及運輸，郭衍銀等[39]在生姜上得出了相同的結論。

植物體中的 Ca、Mg、Cu、Zn 和 Fe 元素在構成細胞結構、信號轉導、葉綠素合成、構成酶活性中心和參與酶促反應中發揮重要作用。本研究中具根結線蟲的文冠果苗木根系中的 Cu、Zn 和 Fe 含量升高，積聚效應明顯。這種積聚作用可能與根結截留根系吸收的礦質元素，使其無法外運有關；也可能是根結線蟲發育需要高濃度的離子環境。通過某種途徑富集各種礦質元素營造適宜的生存環境，具體是哪種原因還有待進一步探討。

具根結的一年生文冠果苗木生長勢并未受消弱，其根、莖、葉部中不同礦質元素對根結線蟲侵染的響應不同。根系響應最強，其次是葉片，莖部響應較弱。根系中N元素含量與根系線蟲侵染率顯著負相關，Zn、K元素含量所受影響次之，二者含量與侵染率均顯著正相關(P<0.05)；葉部的Mg、Zn元素含量受到根線蟲侵染率的影響較為顯著，而葉部K元素響應生物量變化最顯著(P<0.05)，與根線蟲侵染后生物量的變化顯著負相關；莖部N、P元素含量變化顯著，與根結線蟲侵染率呈負相關。該研究結果為根結線蟲侵染對文冠果苗木生長發育的影響及其機理的挖掘奠定了較好的基礎。

致謝：感謝青島農業大學植物線蟲實驗室趙洪海教授對本研究的大力支持。