懷古顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

林禹澎 姜英子* 解生旭 徐雅娟

1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012

懷古顆粒由骨碎補(bǔ)6 g、山茱萸2.2 g、懷牛膝2.2 g、川芎1.2 g、鹿茸0.16 g五味藥材組成，具有增強(qiáng)骨密度，預(yù)防骨質(zhì)疏松保健功能。五味藥材作為骨傷科常用中藥，其在治療骨質(zhì)疏松癥方面的運(yùn)用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，為臨床治療骨質(zhì)疏松方劑中的常用藥物[1～6]。骨碎補(bǔ)為方中君藥，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨，治筋骨瘺軟之功效[7]，柚皮苷為其主要成分。研究采用HPLC高效液相色譜法測(cè)定懷古顆粒中柚皮苷的含量，為懷古顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-2010C高效液相色譜儀；FA2004B萬分之一天平；GA-425十萬分之一天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 材料 懷古顆粒(廠家：北京海潤(rùn)德醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；批號(hào)：20181201，20181202；20181203)對(duì)照品柚皮苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇購(gòu)自Fisher，為色譜純；水為雙蒸水自制；冰醋酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 采用安捷倫Eclipe XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm；進(jìn)樣量：10 μL；上述色譜條件下，柚皮苷對(duì)照品與其他組分峰分離度良好。色譜圖如圖1所示。因該顆粒所含成分較多，此條件下其他成分無法得到有效的分離，故在2～4 min有些許雜峰，其不影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷0.305 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，超聲處理(功率300 W，頻率40 KHZ)30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性及范圍 精密吸取上述對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以柚皮苷進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，結(jié)果顯示，柚皮苷含量在0.061～0.427 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度考察 取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄柚皮苷峰面積。以積分峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差，反映儀器的精密度，計(jì)算其RSD值為0.85%，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 根據(jù)2.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、24 h后，精密吸取10 μL，進(jìn)樣，測(cè)定供試品中柚皮苷的峰面積值，計(jì)算RSD值為1.16%，表面柚皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察 稱取同一批供試品6份，每份精密稱定0.25 g，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，計(jì)算柚皮苷的含量，得RSD值為2.13%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

2.8.1 對(duì)照品溶液的制備 同2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備。

2.8.2 加樣對(duì)照品溶液制備 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.32 mg的溶液，即得。

2.8.3 回收率供試品溶液制備 精密量取已知含量的供試品溶液0.125 g，共6份，分別精密加入加樣對(duì)照品溶液1 mL后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。計(jì)算加樣回收率，結(jié)果為：柚皮苷的平均回收率為99.01%，RSD為4.41%。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱考察 對(duì)不同型號(hào)的色譜柱進(jìn)行了考察，在SHIMADZU VP-ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三根色譜柱中，XDB-C18的保留時(shí)間最短為10.2 min，理論塔板數(shù)最大，為2888，故選用此柱。

3.2 流動(dòng)相考察 在甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)的基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)為流動(dòng)相時(shí)所得的供試品色譜圖峰型較好，且保留時(shí)間更短，理論塔板數(shù)最大，故選流動(dòng)相比例為甲醇-醋酸-水(36∶4∶64)。

3.3 提取方法考察 在懷古顆粒供試品溶液的制備中，考察了不同的提取方法，分別為甲醇超聲提取方法、乙醇超聲提取方法和甲醇加熱回流提取方法。三種提取方法測(cè)定的含量分別為2.584、2.425、2.537 mg/g，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取方法柚皮苷損失較少，方法操作簡(jiǎn)便，故選用次提取方式。

3.4 方法學(xué)考察 由線性考察結(jié)果可知柚皮苷在含量為0.061～0.427 μg范圍內(nèi)線性良好，可作為懷古顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)；精密度考察的RSD為0.85%，說明儀器精密度良好；重復(fù)性考察的RSD為2.13%，表面該含量測(cè)定方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性考察的RSD為1.16%，表面柚皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；回收率實(shí)驗(yàn)的平均回收率為99.01%，RSD為4.41%，符合中華人民共和國(guó)藥典的要求。

4 結(jié)論

懷古顆粒中骨碎補(bǔ)主要含黃酮類、三萜類等成分[8]；山茱萸主要含有環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)等成分[9]；懷牛膝主要含有甾酮類、生物堿等成分[10]；川芎主要含有酚類、有機(jī)酸類等成分[11]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所建立的含量測(cè)定方法能有效地分離出柚皮苷成分，且所建立含量測(cè)定方法重現(xiàn)性、加樣回收率、精密度等均符合藥典規(guī)定，故將此方法用于懷古顆粒中柚皮苷的含量測(cè)定。