益腎養髓方對脊髓型頸椎病大鼠受損脊髓微血管再生的影響

唐彬，朱立國，陳忻，楊博文，秦曉寬，金哲峰，魏戌，劉志偉，孫凱，銀河

1.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；

2.北京中醫藥大學，北京 100029

脊髓型頸椎病（cervical spondylotic myelopathy，CSM）是由于椎間盤及頸椎小關節退變、椎體邊緣骨贅形成，對椎管形成占位并壓迫脊髓或支配脊髓的血管，造成脊髓受壓和/或缺血而引起的脊髓傳導功能障礙性疾病。CSM可導致患者明顯的肢體感覺或運動功能障礙。益腎養髓方針對該病本虛標實病機，以益腎活血類中藥為主，用于治療CSM早、中期病情平穩、手術指征不明顯患者獲得比較滿意的療效。本研究針對CSM受壓后局部出現微循環障礙的病理特點，采用脊髓慢性壓迫法建立CSM大鼠模型，觀察益腎養髓方對模型大鼠神經功能評分、受損脊髓組織形態及微血管形態的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠30只，體質量240～280 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2017-0033。飼養于室溫、通風良好、自然光照環境，自由攝食飲水。喂食大鼠繁殖顆粒飼料，適應性喂養1周。

1.2 藥物及制備

益腎養髓方（巴戟天9 g，熟地黃12 g，鹿角霜12 g，白芍12 g，黃芪15 g，桂枝6 g，丹參9 g，鬼箭羽12 g，羌活6 g），飲片購于中國中醫科學院望京醫院藥劑科，煎煮后水浴濃縮，用純凈水對濃縮后的藥液進行等比稀釋，配制成濃度分別為0.419、0.837、1.674 g/mL的低、中、高濃度藥液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（貨號G1120）、CD34多克隆抗體（貨號K009406P）、中性樹膠（貨號G8590）、檸檬酸鈉抗原修復液（貨號C1031）、蘇木素染色液（貨號G1080），北京索萊寶科技有限公司。刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、直鉗、單關節骨剪，上海醫療器械（集團）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，型號KH-5000E），電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號AE160），組織脫水機（德國徠卡公司，型號ASP200S），組織包埋機（德國徠卡公司，型號EG1150C），石蠟切片機（德國徠卡公司，型號RM2245）。

1.4 造模、分組及給藥

將大鼠分為假手術組（6只）和造模組（24只），采用吸水膨脹材料聚乙烯醇聚丙烯酰胺互穿網絡水凝膠（北京師范大學化學學院提供）壓迫脊髓法制備CSM大鼠模型。2%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，剃除頸背部毛發，常規碘伏消毒，頸椎后正中切口3～4 cm，切開皮膚，暴露頸肩部肌肉群，找到最高突起處及C棘突，自下向上正中切開肌肉群并向兩側牽拉，用刀片剝離棘突兩側附著的肌肉，暴露頸椎椎板，剔除椎板間黃韌帶，從C～T間隙將吸水膨脹材料（1.5 mm×0.7 mm×0.3 mm）向上植入C～C椎板，植入后逐層縫合肌肉、皮膚。假手術組采用同樣方法暴露椎板，剔除椎板間黃韌帶，將同體積吸水膨脹材料植入C～C椎板后隨即取出，不造成持續脊髓壓迫。術后連續3 d肌肉注射青霉素（8萬U/d）預防感染，常規條件飼養，每日早晚人工擠壓膀胱協助排尿，至形成反射性排尿為止。為使大鼠脊髓急性壓迫轉為慢性壓迫，術后適應性觀察2周后開始灌胃給藥。根據Basso Beattie Bresnahan（BBB）評分將造模大鼠隨機分為模型組及益腎養髓方低、中、高劑量組，每組6只。給藥劑量以70 kg成人與200 g大鼠的體表面積進行換算，分別灌胃4.19、8.37、16.74 g/kg（相當于臨床成人用量的0.5、1、2倍）益腎養髓方藥液，模型組和假手術組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續4周。

1.5 行為學評分

BBB評分用于評估大鼠后肢運動功能的恢復情況。將大鼠置于平臺上，觀察記錄其后肢的行走及肢

體活動，正常大鼠滿分21分。分別于灌胃前和灌胃第2、4周對大鼠進行BBB評分。

1.6 取材

戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，手術剪打開大鼠胸腔，暴露心臟，將灌流針針頭從左心室靠近心尖搏動處插入，用0.9%氯化鈉溶液250 mL沖洗，待肝臟和肺臟顏色轉白且右心房流出液體澄清，再用4%多聚甲醛溶液進行灌流，當大鼠出現四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身強直時停止灌流。取C～C節段脊髓，置于4%多聚甲醛中固定，用于HE、免疫組化染色。

1.7 HE染色

將脊髓組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脫水，每個梯度10 min，蘇木素染色，蒸餾水沖洗，伊紅染色，蒸餾水沖洗，梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察脊髓組織病理變化。

1.8 免疫組化染色

石蠟切片按“1.7”項下步驟脫蠟后，3%HO浸泡10 min，自來水沖洗，檸檬酸緩沖液煮3 min×2次，進行熱抗原修復，PBS沖洗2次，加6%山羊血清于37 ℃溫箱孵育30 min，滴加CD34一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，滴加二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB染色，蘇木素復染，自來水沖洗，常規脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

參照Weidner方法進行微血管計數。先在40倍光鏡下觀察整張切片，尋找微血管密度較高區域，即“密集區”。隨后在400倍光鏡下計數被染成棕色的血管內皮細胞簇，與鄰近微血管分開且有微血管腔者計為1個微血管。每只大鼠微血管數以5個400倍視野下微血管數目平均值計算。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 益腎養髓方對模型大鼠行為學評分的影響

與同一時點假手術組比較，模型組大鼠BBB評分明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，益腎養髓方高劑量組大鼠灌胃第2周BBB評分明顯升高（＜0.05），益腎養髓方高、中劑量組大鼠灌胃第4周BBB評分明顯升高（＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠不同時點BBB評分比較（±s，分）

2.2 益腎養髓方對模型大鼠脊髓組織病理形態的影響

假手術組大鼠脊髓組織神經細胞形態完好，細胞核完整，脊髓組織結構正常，無空泡樣改變；模型組大鼠脊髓組織可見大量神經細胞核固縮，細胞腫脹、壞死，有大量纖維瘢痕組織及大空泡樣改變；益腎養髓方低劑量組大鼠脊髓組織可見大量小空泡樣改變及固縮的神經細胞核呈游離狀態分布，存在形態正常的神經細胞；益腎養髓方中劑量組大鼠脊髓組織空洞較小，有少量纖維瘢痕組織及固縮的神經細胞核，神經細胞形態趨于正常；益腎養髓方高劑量組大鼠脊髓組織可見少量空洞及纖維瘢痕組織，空洞周圍存在大量神經細胞，有少量神經細胞核固縮，細胞核分布逐漸集中。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織形態（HE染色，×400）

2.3 益腎養髓方對模型大鼠脊髓組織微血管數目的影響

免疫組化染色可見微血管內皮細胞胞漿被染成棕黃色，微血管呈梭形或分支狀分布。假手術組大鼠脊髓前動、靜脈及微循環血管管腔清晰，形態正常；模型組大鼠脊髓慢性壓迫處脊髓前動、靜脈受壓變扁，微血管稀疏、管壁變薄，邊界不清，白質受壓嚴重處微血管數目減少，灰質僅見少量微血管分布；益腎養髓方低劑量組大鼠脊髓前動、靜脈受壓變形，受壓處白質、灰質微血管數目減少，但優于模型組；益腎養髓方中、高劑量組大鼠脊髓前動、靜脈受壓變形，受壓處白質、灰質有微血管分布，且微血管數目較益腎養髓方低量組有所增加。

與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織微血管數目明顯減少，差異有統計學意義（＜0.05）；與模型組比較，益腎養髓方中、高劑量組大鼠脊髓組織微血管數目明顯增加，差異有統計學意義（＜0.05）。見圖2、表2。

表2 各組大鼠脊髓組織微血管數目比較（±s，個）

圖2 各組大鼠脊髓組織CD34陽性表達（免疫組化染色，×400）

3 討論

根據臨床癥狀，CSM屬中醫學“痙證”“痿證”范疇，其病位在脊髓，病機主要為氣滯血瘀，阻滯經絡而出現機體失用。與現代醫學認為脊髓受壓、脊髓血供減少、脊髓神經功能障礙觀點相符。脊髓微循環功能正常是維持脊髓神經功能的基礎，脊髓血供的60%～70%由脊髓前正中縱行的脊髓前動脈及相應的溝動脈提供。脊髓前動脈最易受到椎體骨突、椎間盤的壓迫，機械壓迫導致脊髓血管內皮細胞破裂，基底膜外露，血小板黏附，甚至形成微栓子，造成髓內小動脈與小靜脈阻塞。壓迫脊髓造成的脊髓微循環障礙不僅與應激性激活凝血系統使血液處于高凝狀態有關，也與血管內皮損傷有關，還與自由基引起微血管閉塞或痙攣，從而導致延遲性缺血等有關。缺血缺氧也可導致細胞營養供應不足，進而誘導或加重神經細胞自噬。脊髓受壓除直接損傷血管外，也可能使脊髓后橫徑增大，橫向走行的血管被拉長，血管口徑變小，脊髓微血管循環改變、脊髓血供減少而影響脊髓功能，出現神經癥狀。可見，脊髓血供與脊髓微血管形態、面積是否正常相關，脊髓微循環功能又取決于神經元的數量和功能。

CD34分子是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，選擇性地表達于血管內皮細胞表面，是血管內皮細胞中較敏感的分子標記物。CD34可激活血管內皮細胞，使其在黏附分子和趨化因子的共同作用下發生遷移，有利于內皮修復和血管重建。故CD34分子能較好地反映大鼠脊髓組織微循環的改善情況。

針對CSM氣滯血瘀致肝腎虧虛的病機特點，采用補益肝腎、活血通督為主要治法。益腎養髓方是課題組在經典名方地黃飲子基礎上結合大量臨床經驗總結提煉而成，方中巴戟天補腎溫陽、強筋壯骨，熟地黃補血滋陰、益精填髓，二藥合而為君；臣藥鹿角霜溫腎助陽，白芍養陰柔肝；佐使藥黃芪、桂枝益氣升陽、溫經通脈，鬼箭羽、丹參活血通經、通絡止痛，羌活祛風濕、利關節，助太陽氣化，暢督脈經氣，使藥力達于頸部。針對CSM“本虛標痹”的病機，共奏補肝益腎、活血通經之效。益腎養髓方灌胃干預可顯著促進大鼠脊髓壓迫后神經功能的恢復。通過不同灌胃劑量比較發現，益腎養髓方高、中劑量效果較好。有研究顯示，溫陽通督類中藥可顯著降低家兔血液黏稠度，減少紅細胞壓積及降低紅細胞聚集指數，促進神經修復，與本研究結果一致。益腎養髓方中丹參主要成分丹參酮ⅡA磺酸鈉可改善脊髓缺血再灌注損傷。黃芪能降低脊髓缺血損傷大鼠血清神經元特異性烯醇化酶濃度，降低水通道蛋白4表達，減輕脊髓水腫；還能緩解受壓后脊髓的脂質過氧化反應，改善微循環，從而起到保護脊髓的作用。以上研究為益腎養髓方的療效提供了相關藥理學證據。

綜上，益腎養髓方可提高CSM模型大鼠行為學評分，改善受損脊髓組織形態，減少纖維瘢痕組織產生，促進脊髓慢性壓迫后神經細胞的修復，同時增加脊髓微血管數目，具有改善脊髓血液循環、恢復血液供應及脊髓功能的作用。