天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠Atg8、LC3及p62表達的影響

邵樂，李蘇，雍蘇南

湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

據統計，全球現有高血壓患者已超過10億，每年近200萬人因血壓升高導致死亡。高血壓病已成為危及人類健康的首要疾病，但其發病機制尚未完全闡明。已有研究表明，炎癥狀態下炎癥因子穩態失衡，導致血管結構改變，血管重塑明顯，從而引發高血壓。自噬與炎癥小體激活關系密切，可通過參與細胞器新陳代謝和能量產生，發揮調控炎癥作用。同時，自噬本身也是高血壓的病理因素之一，研究發現，在腎血管性高血壓模型中可見線粒體自噬增強，而使用纈沙坦干預可明顯抑制線粒體自噬，降低血壓，保護靶器官。天麻芎苓止眩片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療高血壓經驗方復方七芍降壓片化裁而成。課題組前期研究表明，天麻芎苓止眩片降低血壓與減輕炎癥反應、保護血管內皮損傷、改善血管重塑、保護腎功能有關。本實驗采用天麻芎苓止眩片干預自發性高血壓大鼠，觀察其對大鼠血清炎癥因子白細胞介素（IL）-1、IL-10含量和胸主動脈組織Atg8、LC3、p62表達的影響，明確天麻芎苓止眩片治療高血壓的作用機制，為其臨床應用與后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性自發性高血壓大鼠30只，8周齡，體質量180～200 g；雄性WKY大鼠10只，體質量180～200 g，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心。

1.2 藥物及制備

天麻芎苓止眩片（天麻15 g，鉤藤15 g，野菊花12 g，川芎10 g，茯苓15 g，法半夏6 g，牡蠣6 g，地龍15 g，鉤藤10 g，羅布麻18 g，酸棗仁9 g，甘草6 g，香附10 g，丹參15 g），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心制備，規格0.46 g/片，批號20200216，將藥物研磨成粉，加超純水溶解，配制成濃度為4.32 mg/mL藥液。卡托普利片，特一藥業集團股份有限公司，批號20200518，規格25 mg/片，研磨成粉后加超純水溶解，配制成濃度為0.76 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠IL-1、IL-10 ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號分別為GR2020-06、GR2020-12），p62、LC3、Atg8一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為AI48095842、CW88845705、EE74800668）。BP2010智能無創血壓計，北京軟隆科技有限公司；PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BX50顯微鏡，日本OLYMPUS公司；CFX Connect型定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司。

1.4 分組及給藥

30只自發性高血壓大鼠隨機分為模型組、卡托普利組和天麻芎苓止眩片組，每組10只，另設10只WKY大鼠為正常對照組。卡托普利組和天麻芎苓止眩片組分別予7.6、43.2 mg/kg相應藥液灌胃，正常對照組及模型組予蒸餾水灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續8周。

1.5 檢測指標

1.5.1 收縮壓測定

1.5.2 炎癥因子檢測

干預結束后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，經腹主動脈取血，室溫靜置10～20 min，2 000 r/min離心20 min，收集血清，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-1、IL-10含量。

1.5.3 胸主動脈病理形態觀察

分離大鼠胸主動脈，取部分組織置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，透明，將已透明組織置于石蠟中浸蠟，包埋，切片（厚度5 μm），常規HE染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察胸主動脈病理變化。

1.5.4 免疫組化檢測

取大鼠胸主動脈組織石蠟切片，依次放入二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇中脫蠟，10%山羊血清室溫封閉5～10 min，滴加Atg8、LC3、p62一抗（均為1∶100），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB染色5 min，蘇木素復染，分化，返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，采集圖像，以棕黃色染色為陽性表達，計算陽性表達的積分光密度（IOD）。

1.5.5 Western blot檢測

一是把自己的思想裝進別人的腦袋，二是把別人的錢裝進自己的口袋。前者成功了叫老師，后者成功了叫老板，兩者都成功了叫老婆。

取大鼠胸主動脈組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。滴加Atg8、LC3、p62一抗（均為1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次。加入HRP標記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜5 min×3次，ECL發光液顯影，凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH為內參，采用AlphaEase FC軟件分析目的蛋白灰度值。

1.5.6 RT-PCR檢測

取大鼠胸主動脈組織，加入Trizol試劑，4 ℃充分勻漿，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿振蕩15 s，室溫靜置5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，加等體積異丙醇沉淀RNA，加入DEPC水溶解RNA沉淀，按試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA。PCR反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、10s，60 ℃、20 s，72 ℃、15 s，85 ℃、10 s，25 ℃、30 s，共45個循環，引物序列見表1。以GAPDH為內參，采用2法計算mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。實驗數據以±表示，多組間比較符合正態性及方差齊性采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠收縮壓的影響

與同時點正常對照組比較，模型組大鼠收縮壓明顯升高（＜0.05）；給藥第1周開始，與模型組比較，卡托普利組大鼠收縮壓明顯降低（＜0.05）；給藥第3周開始，與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠收縮壓明顯降低（＜0.05）；給藥第6周后，天麻芎苓止眩片組與卡托普利組大鼠收縮壓差異無統計學意義（＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠給藥不同時點收縮壓比較（±s，每組10只）

2.2 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠血清白細胞介素-1、白細胞介素-10含量的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-1含量明顯增加，IL-10含量明顯減少（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠血清IL-1含量明顯減少，IL-10含量明顯增加（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清IL-1、IL-10含量比較（±s，每組10只）

2.3 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈病理形態的影響

HE染色顯示，正常對照組大鼠胸主動脈內膜連續、平整，內皮完整，平滑肌細胞整齊排列；模型組大鼠胸主動脈內膜粗糙、斷裂，平滑肌細胞增多且排列紊亂，血管壁顯著增厚；天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動脈內膜損傷減輕，平滑肌細胞排列較為規則，管壁厚度正常。見圖3。

圖3 各組大鼠胸主動脈形態（HE染色，×400）

2.4 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達明顯降低（＜0.05）。見表2、圖4。

表2 各組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白表達比較（±s，IOD）

圖4 各組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

Western blot結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠胸主動脈組織Atg8、p62蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，天麻芎苓止眩片組和卡托普利組大鼠胸主動脈組織Atg8、p62蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低（＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 各組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62蛋白免疫印跡

圖6 各組大鼠胸主動脈組織p62、LC3、Atg8蛋白表達比較（±s，每組10只）

2.5 天麻芎苓止眩片對自發性高血壓大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，卡托普利組和天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達明顯降低（＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3Ⅱ、p62 mRNA表達比較（±s）

3 討論

高血壓病屬中醫學“眩暈”“頭痛”范疇，其病機可用虛、瘀、風概括，以肝腎陰虛為本，肝陽上擾、瘀血阻絡為標。天麻芎苓止眩片以天麻為君，平肝熄風止痙，臣以鉤藤、川芎活血行氣、祛風止痛，佐以茯苓、法半夏、野菊花健脾化痰、平肝清熱，全方共奏平肝熄風、健脾逐瘀之效。

有研究表明，炎癥因子IL-1可以損傷血管內皮細胞及平滑肌細胞，引起血管壁管腔狹窄，增加血管阻力，在高血壓發生、發展過程中發揮重要作用。IL-10是一種與高血壓密切相關的抗炎因子，可以通過抑制IL-1、IL-8等促炎因子的產生減輕炎癥損傷，從而保護內皮組織，抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移，進而降低血壓，改善血管重塑。本研究中，與正常對照組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1含量增加，IL-10含量減少，大鼠胸主動脈內膜粗糙、斷裂，表明存在炎癥穩態失衡及內皮損傷。與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠血壓降低，血清炎癥因子IL-1含量減少，IL-10含量增加，胸主動脈內膜損傷及炎癥水平得到明顯改善。

線粒體應激損傷與心血管疾病、炎癥反應和代謝疾病聯系密切，線粒體自噬是通過溶酶體選擇性清除受損線粒體的質量控制機制。Atg8是自噬體形成的關鍵蛋白，通過與磷脂酰乙醇胺結合參與自噬體膜的形成。LC3是Atg8的同源形式之一，定位在自噬體膜上，是目前檢測和研究自噬機制的標志性蛋白。LC3是參與自噬小體形成的主要蛋白，當自噬發生時，胞質型LC3（LC3Ⅰ）被APG7L/Atg7激活，轉變成膜型LC3（LC3Ⅱ）并附著于自噬體膜上，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可評估自噬水平的高低。

線粒體自噬過程中，LC3接頭蛋白和LC3受體發揮了關鍵作用，其通過泛素依賴、獨立途徑或與受體直接作用的方式識別受損線粒體。泛素結合蛋白p62是LC3接頭蛋白之一。p62含泛素結合域（UBD）和LC3相互作用基序（LIR），在通過UBD結合耦聯于線粒體蛋白K63的多聚泛素化底物時，其LIR與自噬體膜上的LC3受體直接結合，誘導自噬。以p62為代表的LC3接頭蛋白是引導自噬體與泛素化分子結合的橋梁，自噬發生時，其作為泛素化底物被包裹進自噬小體降解，通常p62水平與自噬活性成反比。

本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠胸主動脈組織自噬相關蛋白Atg8、LC3、p62表達升高，推測在高血壓病理條件下，血管內皮細胞線粒體自噬過度激活，進而出現內皮功能障礙，導致高血壓發生；與模型組比較，天麻芎苓止眩片組大鼠胸主動脈組織Atg8、LC3、p62表達降低，且與卡托普利組水平相當，表明天麻芎苓止眩片能改善內皮損傷，抑制線粒體過度自噬。通常情況下，p62水平與自噬程度成反比，而在本研究中，模型組p62和LC3Ⅱ表達同時升高，可能與自噬底物p62在自噬早期存在清除滯后現象，或p62與自噬體膜結合不牢固有關。天麻芎苓止眩片組和卡托普利組p62和LC3Ⅱ表達同時減少，可能是存在其他非自噬途徑參與p62的合成與降解，導致p62表達的滯后性。因此，將p62作為自噬標記物可能無法真實反映自噬水平。

綜上所述，天麻芎苓止眩片能有效降低自發性高血壓大鼠血壓，其機制可能與改善炎癥穩態失衡、調節血管內皮細胞自噬、改善內皮功能有關。同時本研究發現，p62作為自噬標記物可能無法準確評價細胞自噬的真實狀態。今后本課題組將繼續深化自噬與高血壓的關聯機制、炎癥與自噬相互作用及天麻芎苓止眩片的干預研究，以期為高血壓的中醫藥防治提供參考。