隔藥餅灸對動脈粥樣硬化易損斑塊兔RhoA/ROCK1/MMP-9信號通路的影響

馬逸杰，廖意娟，饒澤華，宋家薇，易麗貞，吳雪芬，劉欣，岳增輝

湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是臨床常見的以血管彈性下降甚至消失為特點的血管性疾病，通常由于脂質沉積于血管內壁形成斑塊所致。AS后期形成的斑塊可根據其是否具有破裂出血傾向分為穩定斑塊和不穩定斑塊，其中不穩定斑塊又稱易損斑塊。易損斑塊通常具有薄的纖維帽、大的脂質核心及大量炎癥相關細胞。當斑塊膠原纖維含量下降導致纖維帽變薄時，斑塊的不穩定性增加，易損斑塊形成。研究表明，AS的形成和發展與Ras同源物基因組成員A（RhoA）/Rho相關卷曲形成蛋白激酶（ROCK）信號通路及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）關系密切。課題組前期研究發現，隔藥餅灸在降低血脂、調節膽固醇、治療AS及穩定易損斑塊方面具有明顯作用。因此，本研究通過檢測AS易損斑塊兔血脂水平，腹主動脈內膜、中膜形態和RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達，以及膠原纖維含量，探討隔藥餅灸穩定AS易損斑塊可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性普通級新西蘭大耳白兔70只，體質量（2±0.2）kg，湖南太平生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2020-0005。于湖南中醫藥大學動物中心實驗室單籠飼養，溫度18～24 ℃，濕度50%～70%，12 h明暗周期，自由飲水。實驗中對動物的處置嚴格遵照中華人民共和國2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，實驗動物操作經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（LL2019081905）。造模用高脂飼料（含1%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、83.8%基礎飼料），湖南嘉泰實驗動物有限公司提供。

1.2 藥物及制備

丹參、山楂、郁金、澤瀉、大黃藥粉，購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。藥餅制作：每次灸前按等比例取各藥粉3～5 g，用陳醋調成糊狀，制成厚2～3 mm、直徑0.8～1.2 cm的藥餅。阿托伐他汀鈣片，美國輝瑞公司，批號1237304。Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾，上海源葉生物技術有限公司，貨號S32087。艾炷，南陽昊翔藥業有限公司，貨號hx-0258，規格0.4 cm×0.8 cm。

1.3 主要試劑與儀器

Ad5-p53重組載體，深圳賽百諾，批號20130602；斑點蝰蛇毒，廣西醫科大學蛇毒研究所制備；組胺，上海三杰生物，批號20110901；MMP-9、RhoA抗體，湖南艾方生物，貨號分別為AF300248、AF03289；ROCK1、羊抗兔IgG抗體，武漢賽維爾，貨號分別為GB11265、GB23303；DAB顯色劑、HE染液、天狼猩紅染液，武漢賽維爾，貨號分別為G1211、G1005、G1018。E100顯微鏡（日本Nikon公司），JB-P5石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司），RM2016病理切片機（德國徠卡儀器有限公司），Pannoramic DESK全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH公司），D3024R型臺式高速冷凍微量離心機（北京大龍儀器）。

1.4 造模及分組

參照文獻[9]方法，采用高脂飼料喂養＋球囊損傷＋基因轉染＋藥物觸發的方式進行造模。將70只實驗兔隨機分為空白組10只、手術組60只。手術組高脂飼料喂養2周后，行腹主動脈球囊損傷術：20%烏拉坦耳緣靜脈注射（5 mL/kg）麻醉，肝素鈉200 U/kg抗凝，沿兔右側腹股溝下緣股動脈搏動處剔除毛發，切開皮膚及肌肉組織，將右股動脈與其他組織及靜脈血管分離，將股動脈下緣結扎，結扎上緣行穿刺術，逆行插入導引導絲約20 cm，再插入帶有球囊的導引導管，當球囊導管完全插入血管后，撤出導引導絲，繼續插入球囊導管約20 cm，手推式球囊擴張壓力泵注入生理鹽水，轉動壓力泵使大氣壓保持在607.98～810.64 kPa，自近心端將球囊向外緩慢回拉，反復抽拉3次，以達到損傷腹主動脈內皮的目的。撤出導管，結扎右側股動脈，逐層縫合肌肉、皮膚。術后連續3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）防止感染。

手術過程5只兔死亡，存活55只，將存活兔隨機分為模型組、直接灸組、隔藥餅灸、西藥組和抑制劑組，每組11只。術后各組兔繼續高脂飼料喂養并進行相應干預，連續8周。

干預結束后，對除空白組外的所有實驗兔進行基因轉染：20%烏拉坦耳緣靜脈注射（5 mL/kg）麻醉兔，剃除兔左側腹股溝下緣股動脈搏動處毛發，常規消毒，按球囊損傷的方法將球囊送入需轉染部位，用球囊注入滴度為1.0×10VP/mL的Ad5-p53重組載體20 μL，撤出球囊并結扎左側股動脈，逐層縫合肌肉、皮膚。術后連續3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預防感染。基因轉染時間為2周，同時改為普通飼料喂養。

分別于兔處死前48、24 h進行2次藥物觸發，具體操作：腹腔注射斑點蝰蛇毒0.15 mg/kg，30 min后耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg，以誘發斑塊破裂。

1.5 干預

參照《實驗針灸學》及擬人比照法取穴，第1組為“巨闕”、雙側“天樞”“豐隆”，第2組為雙側“心俞”“肝俞”“脾俞”。對兔取穴定位后剪毛，固定于兔臺，直接灸組將艾炷直接粘于穴位上（下有厚3 mm、直徑10 mm的紙質墊盤），點燃施灸，每穴連續灸3壯（約30 min），每日1次，2組穴位隔日交替施灸；隔藥餅灸組將藥餅粘于穴位上，再將艾炷放置于藥餅上點燃施灸，其余操作同直接灸組；西藥組每日抓取固定30 min后，將阿托伐他汀鈣片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）拌入高脂飼料中喂食；抑制劑組每日抓取固定30 min后，經耳緣靜脈分2次注射鹽酸法舒地爾10 mg/（kg·d），間隔3 h；空白組和模型組每日抓取固定30 min，不干預。連續8周。

1.6 取材

耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，腹部正中切口，腹主動脈采血2～3 mL，3 000 r/min離心15 min，吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存。取主動脈弓至髂總動脈分叉處腹主動脈組織，置于4%多聚甲醛中固定。

1.7 檢測指標

1.7.1 ELISA檢測

取離心后血清，按ELISA試劑盒說明書檢測血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.7.2 HE染色

將固定于4%多聚甲醛中的腹主動脈組織取出，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規HE染色，脫水后中性樹脂封片。顯微鏡下觀察腹主動脈內膜和中膜形態。

1.7.3 免疫組化染色

取腹主動脈組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）進行抗原修復，加3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min阻斷內源性過氧化物酶，加3%BSA封閉1 h，滴加稀釋的RhoA（1∶100）、ROCK1（1∶100）、MMP-9（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，脫水，封片，顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達，采用Aipathwell圖像分析軟件計算陽性表達的平均光密度。

1.7.4 天狼猩紅染色

將腹主動脈組織石蠟切片置于天狼猩紅染液中染色8～10 min，脫水，封片，顯微鏡下觀察膠原纖維分布情況，以紅色染色為膠原纖維陽性表達，采用Aipathwell圖像分析軟件計算膠原纖維面積，以膠原纖維面積占組織總面積百分比計算膠原纖維含量。

1.8 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。實驗數據以±表示，滿足正態分布多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗，不滿足正態分布用秩和檢驗。＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

最終存活50只兔，其中空白組8只、模型組9只、直接灸組9只、隔藥餅灸組7只、西藥組9只、抑制劑組8只。

2.1 隔藥餅灸對模型兔血脂水平的影響

與空白組比較，模型組兔血清HDL-C含量顯著減少（＜0.01），LDL-C含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清HDL-C含量顯著增加（＜0.01，＜0.05），LDL-C含量顯著減少（＜0.01）。見圖1。

圖1 各組兔血清HDL-C和LDL-C含量比較（±s，每組7～9只）

2.2 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈病理變化的影響

空白組兔腹主動脈組織結構清晰，內膜光滑完整，內皮細胞排列緊密；模型組兔腹主動脈組織結構紊亂，內膜明顯增厚形成斑塊，表面粗糙，斑塊處有大量脂質沉積及少量紅細胞，內皮細胞結構不完整，內膜、中膜界限模糊；各治療組腹主動脈病理改變均有不同程度改善。見圖2。

圖2 各組兔腹主動脈組織形態（HE染色，×200）

2.3 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組兔腹主動脈組織RhoA和ROCK1蛋白表達顯著降低（＜0.01），隔藥餅灸組、西藥組和抑制劑組兔腹主動脈組織MMP-9蛋白表達顯著降低（＜0.01）。見圖3～圖6。

圖3 各組兔腹主動脈組織RhoA蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組兔腹主動脈組織ROCK1蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組兔腹主動脈組織MMP-9蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖6 各組兔腹主動脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達比較（±s，每組7～9只）

2.4 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈組織膠原纖維含量的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈組織膠原纖維含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔腹主動脈組織膠原纖維含量顯著增加（＜0.01，＜0.05），抑制劑組兔腹主動脈組織膠原纖維含量呈增加趨勢，但差異無統計學意義異（＞0.05）。見圖7、圖8。

圖7 各組兔腹主動脈組織膠原纖維陽性表達（天狼猩紅染色，×100）

圖8 各組兔腹主動脈組織膠原纖維含量比較（±s，每組7～9只）

3 討論

《素問?痹論篇》云：“脈痹不已，復感于邪，內舍于心……所謂痹者，各以其時重感于風寒濕之氣也……痹在于脈則血凝而不流。”AS屬中醫學“脈痹”范疇，主要由痰瘀痹阻血脈而成，故以疏肝理氣通絡、益氣活血祛瘀為主要治法。艾灸主要有溫經通絡、散寒驅邪等功效。藥餅由丹參、山楂、郁金、澤瀉和大黃組成，有活血祛瘀止痛、清心除煩、養血安神之功。現代研究表明，上述藥物有調節血脂的功效。本實驗選擇“巨闕”“天樞”“豐隆”及“心俞”“肝俞”“脾俞”2組穴位交替進行治療，其中“巨闕”“天樞”為心與大腸之募穴，“心俞”“肝俞”“脾俞”分別為其臟腑之背俞穴，“豐隆”為治痰之要穴。因此，選穴采取俞募配伍加治痰的方式以達血脈充盈、疏肝健脾、調理腸胃功效，進而起到活血祛瘀、化痰調脂作用。

AS是眾多心血管疾病的病理基礎，其早期主要以血脂水平升高、脂質在血管內壁沉積為特點。HDL-C、LDL-C含量是反映機體脂質代謝情況的重要指標。HDL-C能將膽固醇從肝外組織轉運到肝臟進行代謝，降低血液膽固醇含量，抑制AS形成。LDL-C能將膽固醇轉運到肝外組織細胞，造成血液膽固醇含量增加，促進AS形成與發展。既往研究發現，隔藥餅灸能有效降低AS兔血清HDL-C、LDL-C、三酰甘油及膽固醇含量。本研究結果表明，經隔藥餅灸干預后，模型兔血清HDL-C含量顯著增加，LDL-C含量顯著減少，提示隔藥餅灸能有效調節AS兔血脂水平。

易損斑塊是在AS末期出現的不穩定性斑塊，易損斑塊破裂將誘導血栓形成，導致血管堵塞，進而引起急性心血管疾病。與穩定斑塊相比，易損斑塊表面纖維帽更薄、脂質核更大，易損斑塊附近炎性因子更多。當斑塊中膠原纖維含量降低時，斑塊的纖維帽變薄，同時，斑塊不穩定性增加形成易損斑塊。RhoA/ROCK信號通路與心血管疾病、糖尿病、神經損傷性疾病和腫瘤等疾病的發生發展密切聯系。RhoA是Rho GTP酶的一個分支，其可以在活性GTP結合形式和非活性GDP結合形式之間循環。ROCK是RhoA下游靶蛋白之一，可分為ROCK1和ROCK2亞型，ROCK1在應力纖維形成中起關鍵作用，ROCK2在吞噬和細胞收縮中起重要作用。MMP-9是一種鋅依賴性內切蛋白酶，主要由內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞等分泌產生，參與斑塊纖維帽中膠原纖維的降解，促進穩定斑塊向易損斑塊轉化，MMP-9的表達受RhoA/ROCK信號通路的調控，抑制RhoA/ROCK信號通路則MMP-9表達降低。本實驗結果表明，經隔藥餅灸治療后，AS兔腹主動脈組織RhoA、ROCK1、MMP-9蛋白表達均顯著降低，表明隔藥餅灸能抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信號通路。當MMP-9蛋白表達降低時，膠原纖維含量明顯增加，提示抑制MMP-9表達能通過減少膠原纖維降解起到穩定斑塊的作用。抑制劑組MMP-9蛋白表達最低，但其膠原纖維含量較其他治療組并未體現升高趨勢，可能由于各治療組能通過多途徑對膠原纖維含量進行調控，具體機制有待進一步實驗研究。

綜上所述，隔藥餅灸可能通過抑制RhoA/ROCK1/MMP-9信號通路，增加膠原纖維含量，進而增加纖維帽厚度，延緩AS發展，穩定易損斑塊。