指紋圖譜結合化學模式識別及TOPSIS分析的涼粉草質量控制研究

謝平，陳秋樺，許鑫鑫，沈金海，郝春莉，林麗麗，陳良華

1.廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建 廈門 361024；2.生化制藥福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361024；3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024；4.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006

涼粉草為唇形科涼粉草屬多年生草本植物涼粉草Benth.的干燥全草。藥理研究表明，涼粉草具有抗心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血壓及保肝等多種功效。涼粉草已收載于《廣東省中藥材標準（第三冊）》、《廣西壯族自治區壯藥質量標準 第二卷（2011年版）》及《上海市中藥飲片炮制規范》等，尚缺乏完善的質量控制標準，隨著研究不斷深入及藥材需求量不斷提高，建立全面的藥材質量分析和控制方法尤為重要。

單一成分無法全面評價中藥材的整體質量，而指紋圖譜可以全面反映中藥材成分的數量及種類；化學模式識別可以對指紋圖譜進行數據降維、識別和分類，強調其差異性，用于篩選質量差異標志物；TOPSIS（逼近理想解排序法）對評價對象與最優項的接近程度進行綜合排序，可用于藥材的質量綜合評價。本研究建立15批不同來源涼粉草的指紋圖譜，結合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等化學模式識別方法，評價不同來源涼粉草的穩定性和一致性，篩選質量差異標志物，對其進行含量測定，構建TOPSIS模型，進行綜合評價分析，實現對涼粉草藥材的質量控制。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A PDA檢測器、LCsolution色譜工作站，日本島津公司；XS205十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；CT15RT型臺式高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；BSA224S萬分之一電子天平，賽多利斯上海有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋，江蘇常州華普達有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW-80型中草藥粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司。

異槲皮苷對照品（批號RP200202，純度≥98%）、迷迭香酸對照品（批號RP180607，純度≥98%），成都麥德生科技有限公司；紫云英苷對照品（批號D20021105，純度≥98%）、咖啡酸對照品（批號D18121724，純度≥98%）、紫草酸對照品（批號D19041017，純度≥98%）、丹酚酸B對照品（批號D19110407，純度≥98%），南京狄爾格醫藥科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。15批涼粉草樣品，經廈門華廈學院環境與公共健康學院賴源發副教授鑒定為唇形科植物涼粉草Benth.的干燥全草，來源信息見表1。

表1 15批涼粉草樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液制備

精密稱定對照品適量，加入甲醇制成濃度分別為咖啡酸0.086 mg/mL、異槲皮苷0.115 mg/mL、紫云英苷0.167 mg/mL、迷迭香酸0.187 mg/mL、紫草酸0.089 mg/mL、丹酚酸B 0.093 mg/mL的混合對照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取涼粉草樣品粉末（過3號篩）約1.0 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）100 mL，加熱回流至近無色，棄去石油醚，揮干，加入60%乙醇30 mL回流提取2 h，濃縮至浸膏，20%乙腈復溶，定量轉移至25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用中譜紅RD-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～9.5 min，18%A；9.5～18.5 min，18%→19%A；18.5～20 min，19%→20%A；20～25 min，20%→22%A；25～35 min，22%→24%A；35～42 min，24%→30%A；42～50 min，30%→18%A），流速1.0 mL/min，檢測波長320 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取涼粉草樣品（S1），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，以7號峰的保留時間和峰面積為參照，計算共有色譜峰的相對保留時間（RRT）和峰面積比值（PAR），結果各共有峰RRT的RSD均小于0.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗

取涼粉草樣品（S1）6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算各共有峰RRT的RSD均小于0.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗

取同一批（S1）涼粉草樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，記錄色譜峰，結果各共有峰RRT的RSD均小于1.5%，PAR的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評價

取15批涼粉草樣品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2012版），設置時間窗寬度為0.1 min，采用中位數法生成指紋圖譜共有模式，選取S1作為參照，進行多點校正，建立涼粉草藥材指紋圖譜。15批樣品共確定14個共有峰，指認出其中6種成分，分別為咖啡酸（2號峰）、異槲皮苷（5號峰）、紫云英苷（7號峰）、迷迭香酸（9號峰）、紫草酸（10號峰）、丹酚酸B（12號峰），見圖1。經前期試驗確認，涼粉草藥材中迷迭香酸含量較高，分離度較好，出峰時間穩定，故以其作為參照峰，計算其他峰的RRT和PAR。15批不同來源涼粉草的相似度為0.718～0.998，除S8樣品外，其他涼粉草樣品的相似度均大于0.900，表明樣品整體差異較小。見表2。

表2 15批涼粉草指紋圖譜相似度評價結果

圖1 15批涼粉草HPLC指紋圖譜及色譜峰指認

2.5 聚類分析

采用SPSS22.0軟件將14個共有峰峰面積標準化后進行聚類分析（組間聯接法結合平方歐式距離），結果見圖2。當分類距離為10時，可分為3類：S3、S15樣品各為一類，其他樣品為一類；當分類距離為5時，15批樣品可聚為5類。

圖2 15批涼粉草樣品聚類分析樹狀圖

2.6 主成分分析

以14個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS22.0軟件進行主成分分析。4個主成分特征值＞1，坡度較陡，累計方差貢獻率為83.165%，可反映指紋圖譜的主要信息。主成分1貢獻率為29.981%，色譜峰3、8、9、10、11、13具有較高載荷值；主成分2貢獻率為22.538%，色譜峰2、5、6具有較高載荷值；主成分3貢獻率為17.385%，色譜峰1、7、12、14具有較高載荷值；主成分4貢獻率為13.261%，色譜峰7、11具有較高載荷值。表明多種成分共同引起涼粉草的質量差異。見表3、表4、圖3。

圖3 涼粉草樣品主成分分析碎石圖

根據表3、表4計算得到4個主成分的特征向量，綜合評分模型F＝0.299 81F＋0.225 38F＋0.173 85F＋0.132 61F，其中，系數為各主成分的方差貢獻率，F、F、F、F為4個主成分的得分（見表5）。

表3 涼粉草樣品主成分特征值及方差貢獻率

表4 涼粉草樣品特征圖譜共有峰旋轉后因子載荷矩陣

表5 15批涼粉草樣品主成分得分

2.7 正交偏最小二乘判別分析

以15批涼粉草樣品為研究對象，以指紋圖譜14個共有峰的相對峰面積作為變量，導入SIMCA14.1軟件，OPLS-DA得分圖見圖4。可以看出，S4、S10、S1、S6、S7、S5、S14為第1類，S9、S12、S11、S2、S8為第2類，其余為第3類，與聚類分析結果一致。以變量重要性投影（VIP）＞1為標準，篩選引起質量差異的標志性成分，共有峰VIP見圖5。結果表明，VIP值由大到小依次為色譜峰11、5、1、2、12、7、3，其中5、2、12、7號峰分別為異槲皮苷、咖啡酸、丹酚酸B、紫云英苷，其他成分有待鑒別。

圖4 15批涼粉草樣品OPLS-DA得分

圖5 涼粉草樣品指紋圖譜共有峰VIP

2.8 咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B含量測定

2.8.1 系統適用性試驗

按“2.3”項下色譜條件，精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL進樣，結果表明，各色譜峰分離度良好，樣品測定無干擾。

2.8.2 線性關系考察

精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，進樣測定，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，見表6。

表6 涼粉草中4種成分線性關系考察結果

2.8.3 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，計算RSD，結果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.82%、0.10%、0.92%、1.28%，表明儀器精密度良好。

2.8.4 重復性試驗

分別稱取同一批（S1）涼粉草樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，結果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的平均含量分別為0.151 3、0.514 1、0.566 8、0.742 1 mg/g，RSD分別為0.72%、1.15%、1.06%、0.74%，表明該方法重復性良好。

2.8.5 穩定性試驗

取供試品溶液，室溫放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.86%、2.03%、0.39%、2.42%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的涼粉草樣品粉末（過3號篩）0.5 g，平行6份，分別加入約與樣品中待測成分含量相等的對照品，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下色譜條件測定，計算咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B的加樣回收率及RSD，結果表明該方法準確性良好，見表7。

表7 涼粉草中4種成分加樣回收率試驗結果

2.8.7 樣品含量測定

取15批涼粉草樣品粉末（過3號篩），按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下色譜條件測定，每批重復測定3次，取平均值，結果見表8。15批涼粉草樣品的咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、丹酚酸B含量分別為0.085 2～0.298 5 mg/g、0.061 6～1.424 5 mg/g、0.079 3～1.507 2 mg/g、0.074 4～0.897 5 mg/g。

表8 15批涼粉草藥材含量測定結果（mg/g，n＝3）

2.9 TOPSIS分析

表9 15批涼粉草TOPSIS歸一化處理后矩陣

表10 15批涼粉草樣品TOPSIS分析結果

3 討論

本試驗分別考察甲醇、乙腈與0.1%磷酸水、0.1%甲酸水、0.2%甲酸水組成的流動相系統。其中乙腈洗脫能力優于甲醇，分析時間較短；0.1%甲酸水溶液作為水相可有效改善峰形，系統能達到較好的分離，且基線平穩。因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相系統。比較檢測波長為280、320、330、360 nm時各色譜峰的出峰情況，在波長320 nm處所得共有峰多，各峰分離度較好、響應較強且基線較平穩。

15批涼粉草藥材指紋圖譜共確定了14個共有峰，并指認出6種成分。不同提取方式對藥材成分的溶出有一定影響，經比較水提、醇提的指紋圖譜峰，水提成分較少、含量較低、分離度較差，故采用乙醇回流方法提取。15批涼粉草樣品的相似度為0.718～0.998，原因可能為種植模式、氣候條件、地理環境及市售混合等對次生代謝成分的積累不同。

涼粉草主要生長在福建、廣東，野生資源相對較多，導致其品質存在一定差異，進而可能影響藥效及使用。本研究采用HPLC建立涼粉草藥材的指紋圖譜，并進行聚類分析、主成分分析、OPLS-DA。確定了14個共有峰，共有峰的相對保留時間差異較小，但相對峰面積差異較大，表明化學成分相同但其含量差異較大；由聚類分析結果可知，除S3、S15外均聚為一類，S3、S15樣品為市售，可能與其系多個產地的混合樣品有關；氣候環境、提取工藝同樣對藥材及其制劑的內在品質產生影響。主成分分析共提取出4個主成分，可反映15批樣品83.17%的信息。結合OPLS-DA，異槲皮苷、咖啡酸、丹酚酸B、紫云英苷為涼粉草藥材質量差異的主要標志性成分。15批不同來源涼粉草藥材含量測定結果顯示，S13（越南）樣品中除咖啡酸外，其他成分含量均較高，可能與其生長地理位置、土壤、水源、光照等因素有關，有待進一步研究。異槲皮苷具有保護心腦血管、降壓、降脂、抗抑郁等生物活性，咖啡酸是抗炎抑菌、調節代謝等生物活性的物質基礎，丹酚酸B為治療冠心病、心絞痛的主要藥效物質，紫云英苷能保護心臟、神經系統、抗潰瘍、抗纖維化，可作為質量控制的指標成分。本研究通過建立HPLC指紋圖譜和含量測定方法，結合化學模式識別及TOPSIS分析，可為評價涼粉草藥材質量提供依據。