老年2型糖尿病病人心血管病死亡相關外周血全基因組DNA甲基化的研究

樊垚 王強 唐吉宏 婁青林 唐偉 顧劉寶

T2DM是一種復雜的多基因多因素疾病。近年來，越來越多的研究者在分子水平探討T2DM的發病機制并關注其早期診斷及預防。大量全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWASs)發現，有240余個易感基因與T2DM或其并發癥有關[1]，然而這些易感基因只能解釋其中很小一部分原因[2-3]。近年來研究發現，在復雜疾病中，除基因組序列變異外，表觀遺傳調控也起到重要作用，因此有必要對糖尿病相關的表觀遺傳學等分子機制進行深入研究[4]。

研究表明，糖尿病是心血管疾病的獨立危險因素，糖尿病病人心血管疾病的發生風險較非糖尿病者增加2～4倍。DNA甲基化是一種重要的遺傳外修飾，是表觀遺傳學的重要組成部分，是調節基因組功能的重要手段。850K芯片可以檢測人全基因組約853 307個CpG位點的甲基化狀態。本研究使用850K Infinium Methylation Beadchip技術檢測老年T2DM病人外周血全基因組DNA甲基化修飾水平，旨在探討DNA甲基化修飾與老年T2DM病人心血管病死亡風險的相關性，并尋找可能的干預靶點，為早期防治糖尿病心血管并發癥提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象均來自南京醫科大學附屬老年醫院糖尿病分階段達標管理(China Staged Diabetes Targeting Management，SDTM)項目注冊的T2DM病人。該項目為開放式隊列隨訪研究，自2010年開始招募入組對象，入組條件為簽署知情同意書且在本院就診的T2DM病人，病人均符合中國T2DM防治指南(2010年版)診斷標準。糖尿病專科護士先對所有入組對象進行電話訪談，以確認每位病人的現狀，再通過當地疾病控制中心系統的居民數據庫對所有死亡數據進行進一步驗證。本研究選取截至2017年12月底結局事件為心血管病死亡的病人12例為死亡組，年齡78～89歲，男10例，女2例。根據巢式病例對照設計，按照性別、年齡進行1:1匹配，采用傾向性評分法，卡鉗值設置為0.02，最終從數據庫中選取截至2017年12月底仍存活的12例病人為非死亡組，年齡78～90歲，男8例，女4例。本研究已通過南京醫科大學附屬老年醫院倫理委員會審核。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指標檢測：入組時采集病人清晨空腹靜脈血4 mL，以分離膠促凝劑保存，4000 r/min離心10 min，取上層血清，采用全自動生化分析儀(雅培c1600)檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、AST、ALT等生化指標。

1.2.2 DNA提取：入組時采集病人清晨空腹靜脈血2 mL以EDTA抗凝，放置于-80 ℃冰箱凍存。使用德國Qiagen公司血液組織DNA提取試劑盒提取外周血DNA。

1.2.3 DNA甲基化水平檢測：入組時使用Illumina公司850K Infinium Methylation Beadchip技術，委托上海晶能生物技術有限公司檢測基因組DNA甲基化程度。850K芯片針對每個CpG位點設計2種探針，即signal A和signal B雙色熒光信號用于檢測非甲基化和甲基化的等位基因。使用R軟件minfi包對原始芯片數據進行預處理，CpG位點的甲基化程度通過β值衡量，計算公式為：β=signal B/(signal A+signal B+100)。有效探針β值的區間為[0，1]，0表示該CpG位點無甲基化，1表示該CpG位點完全甲基化。

1.3 統計學處理

1.3.2 基因組甲基化差異分析：使用Beta MIxture Quantile dilation(BMIQ)法對β值進行標準化處理，利用R語言的limma包建立線性模型并計算每個CpG位點的P值。采用Benjamini & Hochberg法進行多重檢驗校正，根據校正后的P值進行差異甲基化位點的篩選。差異甲基化位點的判斷標準為P<0.05，︱βdifferencecase-control︱>0.1。采用R語言的pheatmap包繪制差異甲基化位點基因的熱圖。

1.3.3 生物信息學分析：將篩選出的差異甲基化位點通過DAVID基因功能分析平臺(https://david.ncifcrf.gov)完成基因本體(gene ontology，GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路分析。采用Benjamini & Hochberg法進行多重檢驗校正，以P<0.05為差異甲基化位點基因在該條GO條目和KEGG通路上顯著富集。

2 結果

2.1 2組基線一般資料和實驗室檢測指標比較 非死亡組HDL-C水平高于死亡組，差異有統計學意義(P<0.05)，其他人口學特征、實驗室檢測指標、疾病史和用藥史差異均無統計學意義。見表1。

2.2 DNA甲基化檢測結果

2.2.1 Illumina Human Methylation 850 BeadChip芯片的評價：芯片在雜交、洗滌、掃描步驟質控良好，使用BMIQ法對β值進行標準化處理，β值均位于[0，1]區間，表示探針有效，所有數據均可用于后續分析。

2.2.2 差異甲基化位點分析：根據評判標準篩選出差異甲基化位點共303個。根據2組樣本在303個差異甲基化位點上的甲基化狀態繪制差異甲基化位點基因熱圖，見圖1。

注：Group A為非死亡組，Group B為死亡組；紅色為高甲基化，藍色為低甲基化圖1 差異甲基化位點基因熱圖

2.3 生物信息學分析結果

2.3.1 GO功能分析：GO功能可分為生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3個部分。計算每個GO條目中差異甲基化位點基因富集程度的P值，結果提示差異甲基化位點基因生物學功能富集于神經系統發育、細胞黏附分子、血糖穩態和樹突發育正調控等生物過程；質膜的組成成分、樹突和細胞質核周區細胞成分；鈣離子結合和序列特異性DNA結合分子功能。見圖2。

圖2 DNA差異甲基化位點基因參與的主要生物過程

2.3.2 通路分析(Pathway 富集分析)：計算每個KEGG通路條目中差異甲基化位點基因富集程度的P值。結果顯示，差異甲基化位點基因顯著富集在細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號通路和炎癥介質對瞬時受體電位離子(transient receptor potential, TRP)通道的調節通路。見圖3。

圖3 DNA差異甲基化位點基因參與的主要信號通路

3 討論

有研究表明，約30%的T2DM病人有心血管并發癥，而70%的T2DM病人死因為心血管疾病[8]。本研究通過對老年T2DM心血管病死亡病人和非死亡病人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的全基因組甲基化芯片檢測，篩選出差異甲基化位點基因，初步為老年T2DM心血管病死亡風險的甲基化譜的建立奠定基礎。

TRP通道在多種心血管疾病的病理生理學中發揮重要作用[9]。TRPV1是哺乳動物TRP離子通道7個亞家族之一。已有研究表明，TRPV1的缺失可能影響中性粒細胞的遷移，促使炎癥因子、趨化因子過度生成，造成心梗后炎癥過度活動、不對稱心室重塑、心功能惡化[10]。TRPV1基因多態性與T2DM遺傳易感性及術中不良心血管事件的發生相關[11]。cAMP是胰高血糖素肽-1受體(glucogan like peptide-1 receptor，GLP-1R)的主要第二信使，其可活化一系列下游分子信號，從而發揮抗氧化應激和抗凋亡等生物學作用[12]。目前大多數研究認為，胰高血糖素肽-1(glucogan like peptide-1，GLP-1)的心血管保護作用獨立于血糖和血清胰島素水平等因素之外[13]，發揮生物學作用的方式是與心臟和血管內皮的GLP-1R相結合[14]。Flamez等[15]發現，GLP-1與胰島B細胞膜上受體相結合，引起細胞內cAMP水平上升，導致細胞膜電生理變化從而刺激胰島素分泌。Dozier等[16]研究發現，GLP-1可通過cAMP/PKA通路抑制炎性反應，從而改善脂多糖誘發的內皮細胞功能障礙。Liu等[17]對自發性高血壓大鼠予以2周西他列汀治療，發現大鼠的腎動脈內皮依賴性舒張功能有所改善，腎功能血流恢復，血壓降低，其機制可能是通過提高cAMP水平，從而進一步激活蛋白激酶K(protein kinase A, PKA)、AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)等分子而發揮作用。以上研究均表明，cAMP/PKA是GLP-1發揮多器官保護作用的一個非常重要的分子通路。

細胞黏附分子在細胞炎癥反應、血栓形成等過程中發揮重要作用。本研究GO功能分析結果顯示，差異甲基化位點基因參與細胞黏附分子的生物學過程。季慧慧等[18]對T2DM病人和正常對照人群的DNA差異甲基化基因進行GO功能分析，發現多個基因參與細胞黏附分子生物過程。成淑英等[19]發現合并不同程度頸動脈或下肢動脈硬化的T2DM病人血清血管細胞黏附分子1水平顯著高于健康對照組。上述研究結果提示，DNA甲基化參與細胞黏附分子生物過程從而影響T2DM病人的心血管疾病進展。

鈣離子結合在動脈鈣化和動脈粥樣硬化過程中起著至關重要的作用[20]。Liang等[21]的研究表明，鈣離子結合在糖尿病病人心血管疾病發展過程中被激活。結合本研究結果可以得出，DNA甲基化參與鈣離子結合分子功能從而影響T2DM病人的心血管疾病進展。

綜上所述，本研究發現DNA甲基化修飾圖譜在老年T2DM病人心血管病死亡組與非死亡組中存在顯著差異，差異甲基化位點基因顯著富集在cAMP信號通路和炎癥介質對TRP通道的調節過程中，提示DNA甲基化作為基因表達調控機制，可能通過參與以上生物學過程對T2DM病人心血管病死亡發揮一定作用。本研究采用850K Infinium Methylation Beadchip技術，有較高的穩定性，研究結果有一定參考價值。但由于本研究樣本量較小，同時缺少功能研究驗證。因此，仍需更多研究來驗證本結果的可靠性。