牛蒡子中木脂素類化學(xué)成分分析方法的研究進(jìn)展

張小倩，張騰騰，盧寶偉，孟祥松，楊雨琴，安鳳霞

（亳州學(xué)院 中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800）

牛蒡子（Fructus Arctii）為菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果實(shí)，又名惡實(shí)，大力子，始載于《名醫(yī)別錄》，為歷代《中華人民共和國藥典》收錄。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為牛蒡子性寒，味辛、苦，歸肺、胃二經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽的功效，主要用于風(fēng)熱感冒，咳嗽痰多，麻疹，風(fēng)疹，咽喉腫痛，痄腮，丹毒，癰腫瘡毒等。牛蒡?yàn)槎晟荼局参铮锛竟麑?shí)成熟時采收，主產(chǎn)于吉林，遼寧，黑龍江，浙江等地。國外分布于日本及歐洲、伊朗、阿富汗、印度等國[1]。

牛蒡作為一種藥食兩用的植物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。在日本，牛蒡的根被稱為“東洋參”，深受當(dāng)?shù)厝说南矏郏芯堪l(fā)現(xiàn)牛蒡根具有降血壓、健脾胃、補(bǔ)腎壯陽的功效，近年來，牛蒡根也作為一種高檔蔬菜出現(xiàn)在國內(nèi)各大超市。牛蒡的種子（牛蒡子）作為傳統(tǒng)中藥，具有悠久的使用歷史，關(guān)于牛蒡子最早的使用記錄可以追溯到魏晉時期，其療效顯著，應(yīng)用廣泛。牛蒡子中化學(xué)成分的研究始于20世紀(jì)30年代，自1929年日本學(xué)者田?川越等首次在牛蒡子中分離出牛蒡子苷元和牛蒡子苷后，關(guān)于牛蒡子中化學(xué)活性物質(zhì)的研究取得了重要的進(jìn)展，目前已經(jīng)從牛蒡子中分離純化出100余種不同類型的天然產(chǎn)物。牛蒡子中化學(xué)成分種類復(fù)雜多樣，主要有木脂素、油脂、揮發(fā)油、三萜、蛋白質(zhì)、多糖等，其中木脂素類成分是牛蒡子的主要成分，中外學(xué)者也將其作為評價牛蒡子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，2020版《中華人民共和國藥典》將木脂素類成分牛蒡子苷作為牛蒡子質(zhì)量評價的指標(biāo)，并規(guī)定其含量不得低于5.0%。牛蒡子中木脂素類成分具有較高的藥理活性，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病等活性[2-15]。為進(jìn)一步闡明其藥理活性，指導(dǎo)合理用藥，發(fā)掘其中有潛力的活性成分，對其物質(zhì)基礎(chǔ)研究至關(guān)重要；不僅如此，近年來隨著分離分析技術(shù)的提高，發(fā)現(xiàn)牛蒡子中仍含有大量的未知木脂素類成分，需要開展更深入的分離制備工作。

1 牛蒡子中木脂素類化合物的基本結(jié)構(gòu)

木脂素（lignans）是一類由苯丙素單位（C6-C3）聚合而成的天然產(chǎn)物，通常指代的是二聚物，少數(shù)是三聚物或四聚物。由于組成木脂素的C6-C3單體縮合位置不同及其側(cè)鏈γ-碳原子上的含氧基團(tuán)相互脫水縮合等反應(yīng)，形成了不同類型的木脂素。最早Haworth把C6-C3單元側(cè)鏈通過β-碳聚合而成的化合物稱為木脂素類，基本母核結(jié)構(gòu)見圖1，后來Gottlich把新發(fā)現(xiàn)的由其他位置連接生成的化合物稱為新木脂素類（neolignan）化合物。

圖1 木脂素母核

木脂素類成分作為牛蒡子中的主要成分，含量豐富復(fù)雜，迄今為止，從牛蒡子中分離出的木脂素類化合物已達(dá)60多個，且它們的基本母核相似，大多是以2個單元苯丙素（C6-C3）通過分β、γ縮合成一個五元環(huán)內(nèi)脂（二芐基丁內(nèi)脂）。

2 木脂素的分析方法

木脂素作為自然界中常見的一類組分，關(guān)于它的分析方法很多，如紫外-可見分光光度法、薄層色譜掃描法、液相色譜法、氣相色譜法、超臨界流體色譜法、毛細(xì)管電泳法以及各種聯(lián)用技術(shù)等。在上述眾多方法中，高效液相色譜法因其高效、快速，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，適用范圍廣等特點(diǎn)，已成為木脂素的主要分析手段。2020版《中華人民共和國藥典》關(guān)于牛蒡子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定部分，就是采用高效液相色譜儀對牛蒡子中主要化合物牛蒡子苷進(jìn)行含量測定。超臨界流體色譜作為一種新型的色譜分析技術(shù)結(jié)合了液相色譜與氣相色譜共同的優(yōu)點(diǎn)，具有諸多優(yōu)勢，如快速、節(jié)約有機(jī)溶劑，適用范圍廣等優(yōu)勢，這些特點(diǎn)使其在天然產(chǎn)物的分析中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，故以下主要介紹液相色譜和超臨界流體色譜以及由其發(fā)展衍生出的新技術(shù)在木脂素類化合物分析中的應(yīng)用。

2.1 高效液相色譜法

液相色譜最早由俄國科學(xué)家茨維特（Tswett）在分離植物色素時發(fā)現(xiàn)，但是受當(dāng)時儀器條件與分離材料的限制，并沒有體現(xiàn)出其出色的分離能力。直到20世紀(jì)60年代，隨著高壓恒流泵應(yīng)用到高效液相色譜儀上，高效液相色譜技術(shù)（High performance liquid chromatography，HPLC）才有了質(zhì)的發(fā)展。如今，HPLC已成為分析天然產(chǎn)物最主要的方法之一，具有樣品用量少、色譜柱可反復(fù)利用、易回收、自動化程度高、成本低等優(yōu)勢。根據(jù)HPLC中流動相與固定相極性大小的區(qū)別，將HPLC分為正相色譜（NPLC）和反相色譜（RPLC），木脂素極性相對較弱，在RPLC中具有很好的保留，利于木脂素的分析。木脂素類成分牛蒡子苷及其苷元為牛蒡子的主要化學(xué)成分，實(shí)現(xiàn)常采用RPLC對其進(jìn)行分析，為了更深入的了解牛蒡子的質(zhì)量，楊亮蕊[16]等采用RPLC對牛蒡子中牛蒡子苷及其苷元的含量進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)采用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相體系為甲醇：水，梯度洗脫條件：30%甲醇（0～5 min），30%～40%甲醇（5～6 min），45%甲醇（6～25 min），0.8 mL/min的流速，25 ℃的柱溫，280 nm的檢測波長。結(jié)果顯示牛蒡子苷及其苷元均實(shí)現(xiàn)了較好的分離度，且整個分析在25 min內(nèi)全部完成。

RPLC的保留機(jī)理主要是固定相與樣品之間的疏水作用力，保留時間會隨著被分析樣品極性的增強(qiáng)而減弱。天然產(chǎn)物中的木脂素多以游離的形式存在，其極性相對較弱，在RPLC上保留較強(qiáng)，同時隨著木脂素母核上羥基的增加，使樣品極性增強(qiáng)，保留減弱。糖基化會使木脂素的極性大大增加，隨著木脂素苷上連接的糖數(shù)量的增加，樣品會變得慢慢溶于強(qiáng)極性溶劑，在RPLC上的保留較弱。此時，采用親水色譜（HILIC）對其分析能夠很好地解決這個問題，實(shí)現(xiàn)較好的保留[17-19]。

HILIC從液相色譜劃分標(biāo)準(zhǔn)來看，可以認(rèn)為是一種特殊的NPLC，但是它又兼容了RPLC的流動相優(yōu)勢。HILIC通常使用水和乙腈等作為流動相，相比NPLC的流動相可以部分解決強(qiáng)極性化合物的溶解性問題，而且又能很好的彌補(bǔ)RPLC對強(qiáng)極性化合物保留較差的不足。HILIC的分離機(jī)理也不同于傳統(tǒng)液相色譜，目前比較成熟的理論認(rèn)為HILIC的固定相表面會形成一層富水層，極性化合物會在這個富水層與流動相之間反復(fù)分配，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)各目標(biāo)化合物的分離。植物化學(xué)研究者在對天然產(chǎn)物研究時，多是采用有機(jī)溶劑提取研究對象中的有效成分，而忽視了大量水溶性的成分，尤其在對中藥有效成分研究時更應(yīng)該多注意親水性成分。牛蒡子水提液中存在大量綠原酸、咖啡酸等簡單苯丙素類成分，這些成分可能是牛蒡子發(fā)揮抗病毒作用的主要成分，但是它們在RPLC上的保留并不理想。此時，采用HILIC對其分析可以實(shí)現(xiàn)一個較好的保留，劉瑤[20]等采用Waters XBridge BEH Amide（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）親水色譜柱在親水模式下測定了參附注射液中綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸的含量。實(shí)驗(yàn)條件為：40℃柱溫，0.8 mL/min的流速，0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）作為流動相，梯度洗脫條件為0～10 min 2%～45% B。結(jié)果顯示綠原酸與咖啡酸等有機(jī)酸在HILIC色譜柱上獲得了較好的保留與分離。現(xiàn)在一些新型HILIC色譜填料不僅對強(qiáng)極性化合物有較好的保留，對于中等極性的化合物也能實(shí)現(xiàn)不錯的保留[21]，大大彌補(bǔ)了RPLC分析的局限性，豐富了分析方法。如Click XIon色譜柱是在硅膠表面鍵合兩性離子，極大地豐富了樣品與固定相之間的保留機(jī)理，既包括傳統(tǒng)的液液分配作用，又含有離子鍵等作用力。Xiujie Guo等[22]采用Click XIon色譜柱在親水模式下分析人參皂苷，在甲醇：水的流動相體系下，各人參皂苷都獲得了一個很好的峰形，得到了較好的保留和分離度。

檢測技術(shù)是液相色譜中的重要部分，被分析樣品的具體情況最終都是通過檢測器捕集到樣品信號反映出來。液相色譜中用于木脂素類化合物的檢測器有很多，主要包括紫外可見光檢測器（UV-vis）、二極管陣列檢測器（DAD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、核磁（NMR）以及質(zhì)譜（MS）等，其中DAD與MS是木脂素檢測時最常用的兩種檢測器。在早期木脂素的研究中主要是利用其苯環(huán)的紫外吸收，多數(shù)木脂素的兩個取代芳環(huán)是兩個孤立的發(fā)色團(tuán)，其紫外吸收峰位置相似，吸收強(qiáng)度也具有加和性。一般在220～240 nm（lgε > 4.0）和280～290 nm（lgε 3.5～4.0）出現(xiàn)兩個吸收峰。近年來MS作為一種高靈敏度的檢測儀器在天然產(chǎn)物分析中的作用越來越大，將其與液相色譜聯(lián)用在天然產(chǎn)物分析中有巨大優(yōu)勢。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）是液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)的完美結(jié)合，它同時兼具了HPLC的分離能力和MS的靈敏檢測能力，對復(fù)雜混合樣品具有很高的選擇性、靈敏度以及廣泛的適用性。如S.C. Halls等[23]采用HPLC-DAD-MS對連翹中的多個木脂素進(jìn)行定性定量研究，牛蒡子苷等7個木脂素化合物通過MS被鑒定出來，DAD檢測器在280 nm下對各木脂素化合物具有很好的響應(yīng)，輕松地實(shí)現(xiàn)了它們的定量工作。

2.2 HPLC新技術(shù)在木脂素分析中的應(yīng)用

近年來液相色譜技術(shù)快速發(fā)展，超高效液相色譜（UPLC）的使用對木脂素類化合物的分析更加有利。根據(jù)范氏方程的理論，減小固定相的粒徑可以降低渦流擴(kuò)散，大大提高色譜柱柱效，利于樣品的分離。1997年，Jorgenson[24]等將2 μm粒徑的固定相應(yīng)用于樣品的分離分析，結(jié)果樣品色譜峰展現(xiàn)出非常高的柱效，并體現(xiàn)出高效、快速的特點(diǎn)。小粒徑填料的色譜柱雖然能夠帶來很高的柱效，但是整個系統(tǒng)的壓力也會隨之大大增加（超過6 000 psi），傳統(tǒng)液相色譜儀已經(jīng)不能滿足如此高的壓力。為了克服這種系統(tǒng)壓力的限制，能耐受更高壓力，具有更小死體積的UPLC應(yīng)運(yùn)而生。商業(yè)化的UPLC系統(tǒng)甚至可以承受高達(dá)18 400 psi的壓力，可以匹配粒徑1.3～2.5 μm等一系列的色譜柱。近十年來，UPLC的分析能力得到廣泛認(rèn)可，并廣泛應(yīng)用于木脂素類化合物的分離分析。Bharathi Avula等[25]開發(fā)了一種高效快速的UPLC-UV-MS的方法分析足葉草中4個木脂素（4-羥基去甲鬼臼脂素、α-盾葉鬼臼素、β-盾葉鬼臼素、鬼臼毒素），實(shí)驗(yàn)采用Acquity UPLCTM BEH C18（50×21 mm i.d.，1.7 μm）色譜柱，流動相體系為乙腈-水，并加入0.05%甲酸。4個木脂素類化合物僅在3 min內(nèi)分析完成，各化合物的檢測限分別為0.1、0.3、0.2、0.3 μg/mL。為了更好的說明UPLC分析木脂素的優(yōu)勢，將其與傳統(tǒng)HPLC分析方法做了比較。首先查閱了關(guān)于足葉草中木脂素合適的HPLC分析方法，這些方法具有較高靈敏度和分辨率，然后統(tǒng)計比較這些HPLC方法[26-27]。發(fā)現(xiàn)常規(guī)的HPLC分析方法將足葉草中的4個木脂素類化合物分析完全需要25～35 min，且檢測限在2.5～5 μg/mL之間。以上比較充分說明了UPLC在分析木脂素時具有快速、高效的特點(diǎn)。

天然產(chǎn)物成分復(fù)雜多樣，一維液相（1D LC）色譜經(jīng)常會因?yàn)樽陨磉x擇性和峰容量不足而導(dǎo)致樣品分離效果較差，使樣品中各化合物的色譜峰擠在一起，無法分開，得不到滿意的分離度。針對上述問題，基于不同分離機(jī)制的二維液相系統(tǒng)（2D LC）能夠提供更好的選擇性和更大的峰容量，解決復(fù)雜樣品分離的難題。常見的二維液相色譜組成模式主要包括NPLC、RPLC、HILIC、離子交換色譜（IEC）、體積排阻色譜（SEC）等。從操作形式上又可以根據(jù)第一維餾分是否直接轉(zhuǎn)移到第二維，將2D LC分為在線[28]和離線[29]兩種模式。在線2D LC分析速度快，結(jié)果重復(fù)性好，但是對儀器設(shè)備的要求較高，需要特定的接口技術(shù)，操作難度也相應(yīng)的增大。不同于在線模式，離線2D LC操作靈活性更高，對儀器要求簡單，但是該方法人為因素過多，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性稍差，而且樣品容易損失與污染。Erni和Frei在分析復(fù)雜植物提取物時，因RPLC選擇性不夠，樣品無法實(shí)現(xiàn)較好的分離，而將凝膠柱與反相柱聯(lián)合使用來解決這種選擇性不足的問題，并首次將這種分離模式名為2D LC。近年來，2D LC已經(jīng)逐漸發(fā)展成熟，廣泛的應(yīng)用于多肽、蛋白質(zhì)以及各類小分子化合物的分離分析和純化制備[30]。鄒漢法課題組[31]構(gòu)建了一個二維反相色譜×反相色譜（2D RPLC×RPLC）用于川芎中多成分的分析，第一維RPLC模式采用氰基柱分析，流動相體系為甲醇-水，以0.04 mL/min的流速洗脫215 min，每5 min收集一次餾分；第二維也在RPLC模式下進(jìn)行，采用ODS柱，乙腈-0.1%乙酸的流動相體系，每個組分均以0.7 mL/min的流速等度洗脫5 min，起始梯度隨著第一維色譜柱洗脫梯度的變化適當(dāng)優(yōu)化。采用該2D RPLC×RPLC方法從川芎提取液中檢測到120種化合物，結(jié)合質(zhì)譜確定了其中的52個化合物，大大提高了川芎中化合物的檢出能力，增加了對川芎基礎(chǔ)物質(zhì)的了解。

2.3 超臨界流體色譜

超臨界流體色譜法(supercritical fluid chromatography；SFC)是以超臨界流體做流動相，依靠流動相的溶劑化能力來進(jìn)行分離、分析的色譜過程，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新技術(shù)[32]。SFC常用的流動相為超臨界狀態(tài)下的二氧化碳（CO2）及氧化亞氮（N2O），其中CO2因性質(zhì)穩(wěn)定、簡單易得和不苛刻的超臨界條件等優(yōu)勢被首選為SFC的流動相。處于超臨界狀態(tài)下的CO2既具有氣體的低粘度，易于傳質(zhì)，又具有液體的高密度，利于溶解。因此使得SFC同時具有了GC和HPLC的特點(diǎn)，它既能分析GC不適應(yīng)的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性樣品，相比HPLC又具有更快的分析速度，是GC和HPLC的一種很好補(bǔ)充。雖然SFC具有分析速度快，分離效率高的優(yōu)勢，但是受儀器技術(shù)水平的限制，其發(fā)展緩慢，并沒有得到廣泛的應(yīng)用。直到2012年，美國Waters公司重新整合設(shè)計了傳統(tǒng)的超臨界流體色譜儀，推出全新的超高效合相色譜（UPC2），為分離分析工作提供了一種全新超臨界流體工具。全新的UPC2系統(tǒng)仍然是基于SFC的原理，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合超高效液相色譜儀的高壓技術(shù)，使儀器能夠耐受更高的壓力，還能保證整個儀器的性能更穩(wěn)定，突破了原有SFC系統(tǒng)壓力波動大、低比例助溶劑時傳輸精度低以及靈敏度差等方面的瓶頸，并且能夠使用小粒徑的色譜柱填料，極大提高了分離效率[33-34]。

UPC2主要采用超臨界狀態(tài)下的CO2作為流動相，是一種經(jīng)濟(jì)的、綠色的分離分析技術(shù)。超臨界狀態(tài)下的CO2是一種非極性溶劑，對天然產(chǎn)物中的非極性化合物具有較好的溶解度和分離能力。UPC2可以使用色譜柱種類眾多、范圍廣泛，其中使用最廣泛的是硅膠色譜柱。由于UPC2固定相的種類涵蓋了從極性的二醇基柱到非極性的C18柱等，使其分析范圍廣泛，對部分強(qiáng)極性化合物也能實(shí)現(xiàn)較好的保留與分離。但是臨界狀態(tài)下的CO2對極性化合物的溶解能力較差，在分析過程中需要加入一定比例的有機(jī)溶劑（如甲醇、異丙醇等）作為改性劑來增強(qiáng)其溶解能力和洗脫能力。不僅如此，對于一些樣品遇到硅醇基發(fā)生拖尾時，也可以在流動相中加入一定量的有機(jī)酸來改善峰形。UPC2的保留機(jī)理與NPLC相似，但又不完全相同，李振宇等[35]考察了進(jìn)樣體積、流動相添加劑、改性劑、柱溫和系統(tǒng)背壓對UPC2保留行為的影響，被測定樣品為吲哚類生物堿標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示進(jìn)樣體積過大時會造成峰形分叉，可能是樣品溶劑與流動相混合時不匹配引起的；隨著流動相添加劑種類的改變，該類生物堿的保留和分離行為并無明顯變化；改性劑的極性增加時，樣品的保留減弱；柱溫升高或系統(tǒng)背壓降低都會使該類生物堿的保留減弱。通過上述條件的考察，作者優(yōu)化UPC2的分析條件，并在15 min內(nèi)完成了吲哚類生物堿的快速分析。由于UPC2的流動相用量少、安全環(huán)保、后處理簡單，并且分析速度快，其在天然產(chǎn)物的分離分析及純化制備中一定會起到越來越重要的作用。

3 結(jié)語

牛蒡子在我國藥用歷史悠久，療效確切，具有廣泛的藥理作用。牛蒡子中化學(xué)成分主要含有木脂素、揮發(fā)油、三萜、油脂等，木脂素類成分是牛蒡子的主要成分，迄今已報道的牛蒡子中的木脂素類成分多達(dá)60多個。該藥材價格低廉，但是療效確切，具有較大的開發(fā)價值。牛蒡子中木脂素類化學(xué)成分分析方法目前有高效液相色譜法、HPLC新技術(shù)在木脂素分析中的應(yīng)用、超臨界流體色譜等。但是，目前關(guān)于牛蒡子中發(fā)揮主要作用的木脂素的研究工作，主要集中于牛蒡子苷與牛蒡子苷元這兩個含量最高的化合物，對于其他微量木脂素的研究很少，也不夠深入，其主要原因是較難獲得純度較高的這些化合物。為了對牛蒡子中木脂素類成分進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步闡明其藥理活性，需要獲得純度較高，質(zhì)量足夠的這些化合物，因此發(fā)展針對牛蒡子中木脂素的高效快速的分離純化技術(shù)至關(guān)重要。